摘要
目的: 在培养原代大鼠心肌细胞的基础上,用血管紧张素Ⅱ诱导新生大鼠心肌细胞肥大为模型,探讨醋柳黄酮及其单体(槲皮素与异鼠李素)抑制心肌肥厚的作用机理是否与钙调神经磷酸酶信号通路有关。 方法: 取新生SD大鼠心肌细胞(1-3d),运用差速贴壁分离法提纯后进行培养。心肌细胞常规培养72小时,换无血清培养基同步化24小时后,分别加入不同药物进行孵育。实验分组:①对照组(Control):不加任何处理因素,与加入处理因素的组别共同进行换液处理;②模型组(AngⅡ):加入AngⅡ10-6mol/L,建立心肌肥厚模型;③醋柳黄酮组(TFH group):预先加入醋柳黄酮100mg/L,再加入AngⅡ10-6mol/L;④槲皮素组(Quer group):预先加入槲皮素100umol/L,再加入 AngⅡ10-6mol/L;⑤异鼠李素组(Isor group):预先加入异鼠李素100umol/L,再加入AngⅡ10-6mol/L;⑥缬沙坦组(Valsartan group):预先加入缬沙坦10-6mol/L,再加入 AngⅡ10-6mol/L。采用抗α-actin免疫组化鉴定心肌细胞;Image-Pro Plus专业图像处理软件测定细胞表面积;考马斯亮蓝法测定细胞总蛋白含量;采用p-NPP酶法测定心肌细胞肌浆网钙泵( Sarcoplasmic reticulum Ca2+-ATPases,SERCA)活力;定磷法测定钙调神经磷酸酶(Calcineurin,CaN)活性及RT-PCR法半定量测定CaN mRNA表达。 结果: ⑴心肌细胞鉴定:心肌细胞经抗α-actin免疫细胞化学染色后,细胞质内可见棕黄色丝状物,证实为心肌细胞。 ⑵心肌细胞表面积:与control组比较,AngII组的细胞表面积显著增加(761.75±95.09 vs498.27±67.31um2, P<0.01),其余各组细胞表面积的增加无统计学差异(P>0.05)。与AngII组相比,Valsartan组、Quer组、Isor组及TFH组的细胞表面积分别减小(552.07±93.48 vs761.75±95.09um2, P<0.01)、(584.22±109.42 vs761.75±95.09um2, P<0.01)、(611.02±149.38 vs761.75±95.09um2, P<0.01)、(572.05±104.37 vs761.75±95.09um2, P<0.01);但这四组之间差异无统计学意义(P>0.05)。 ⑶心肌细胞总蛋白含量:与control组比较,AngII组的细胞总蛋白含量明显增加(4.61±1.42 vs2.63±0.79ng/well, P<0.01),其余各组细胞总蛋白含量的增加无统计学差异(P>0.05)。与AngII组相比,Valsartan组与TFH组的细胞总蛋白含量分别减小(3.04±0.86 vs4.61±1.42 ng/well,P<0.01)、(3.10±0.52 vs4.61±1.42 ng/well,P<0.01);Isor组与Quer组的细胞总蛋白含量分别减小(3.25±0.94 vs4.61±1.42ng/well,P<0.05)、(3.41±0.75 vs4.61±1.42 ng/well,P<0.05);但这四组之间差异无统计学意义(P>0.05)。 ⑷肌浆网钙泵(SERCA)活力:与control组比较,AngII组的SERCA活力明显下降(2.36±0.99 vs4.11±1.19umol/g pro·min, P<0.01),其余各组SERCA活力下降无统计学差异(P>0.05)。与AngII组相比,Valsartan组、Isor组、Quer组及TFH组的SERCA活力均升高(3.89±1.12 vs2.36±0.99umol/g pro·min, P<0.05)、(3.55±1.36 vs2.36±0.99umol/g pro·min, P<0.05)、(3.41±0.79 vs2.36±0.99umol/g pro·min, P<0.05)、(3.52±0.48 vs2.36±0.99umol/g pro·min, P<0.05);但这四组之间差异无统计学意义(P>0.05)。 ⑸钙调神经磷酸酶(CaN)活性:与control组比较,AngII组的CaN活性显著升高(0.50±0.13 vs0.25±0.09U/mg prot, P<0.01),其余各组CaN活性升高无统计学差异(P>0.05)。与AngII组相比,Valsartan组、Quer组、Isor组及TFH组的SERCA的CaN活性分别降低(0.32±0.14 vs0.50±0.13 U/mg prot, P<0.05)、(0.37±0.10 vs0.50±0.13 U/mg prot, P<0.05)、(0.39±0.11vs0.50±0.13 U/mg prot, P<0.05)、(0.36±0.15 vs0.50±0.13 U/mg prot, P<0.05);但这四组之间差异无统计学意义(P>0.05)。 ⑹钙调神经磷酸酶(CaN)mRNA的表达:AngII组、Isor组、Quer组、TFH组及Valsartan组在心肌细胞中(CaN)mRNA的表达均高于Control组(P<0.05), AngII组最高(P<0.01)。与AngII组相比,Valsartan组、Quer组、Isor组及TFH组的CaNmRNA表达量分别降低(1.29±0.08 vs1.84±0.11, P<0.01)、(1.36±0.04 vs1.84±0.11, P<0.01)、(1.44±0.07 vs1.84±0.11, P<0.01)、(1.33±0.05 vs1.84±0.11, P<0.01);但这四组之间只有Isor组与Valsartan组之间的差异存在统计学意义(P<0.05)。 结论: 醋柳黄酮及其单体(槲皮素和异鼠李素)与缬沙坦一样对 AngⅡ诱导的心肌细胞肥大有抑制作用,其作用机制与心肌细胞肌浆网钙泵(SERCA)活性及钙调神经磷酸酶(CaN)信号通路有关。
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