摘要
目的:研究自噬对大鼠局灶性脑缺血再灌注神经功能损伤的影响,探讨自噬诱导剂及抑制剂在不同时间点对脑细胞自噬及大鼠神经功能的影响,探讨蛭龙活血通瘀胶囊预处理对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠脑细胞自噬的影响。方法:将60只体重在250克到350克之间的4周到8周大小的青壮年雄性SD大鼠,完全随机分为a、b、c、d、e五个组。其中a组为假手术组(Sham),b组为正常脑缺血再灌注损伤模型组(MCAO),c组为蛭龙活血通瘀饲养1月后脑缺血再灌注组(活血通瘀+MCAO,以后简称蛭龙组),d组为造模前1小时雷帕霉素干预组(Rapamycin+MCAO,以后简称雷帕组),e组为造模前1小时3-MA干预组(3-MA+MCAO,以后简称3-ma组)。每组分别取3个时间点即脑缺血2h以及再灌注后3h和12h,进行神经功能评分,取2个时间点,即脑缺血再灌注后3h和12h进行取材。c组用蛭龙活血通瘀胶囊灌胃1月,b组用蒸馏水灌胃1月(水的体积与蛭龙组同),d组于造模前1小时侧脑室注射雷帕霉素,e组于造模前1小时侧脑室注射3-MA,分别对各组于脑缺血2小时,再灌注3小时和12小时三个时间点进行神经功能评分,并观察不同时间点脑梗死面积、电镜表现及自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1的表达情况。结果:1.与假手术组比较,模型组、蛭龙组、雷帕组及3-MA组大鼠的神经功能评分在各实验时间点都降低,差异有统计学意义(P<0.01或 P<0.05);与假手术组和模型组比较,活血通瘀胶囊预处理和雷帕霉素预干预,都增加了短暂性脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能评分,差异均有统计学意义(P<0.01),而3-MA组则明显降低了实验大鼠的神经功能评分,差异有统计学意义(P<0.01);2.与假手术组比较,模型组、蛭龙组和雷帕组自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和Beclin1的表达均有所增加,差异有统计学意义(P<0.01或 P<0.05)。与假手术组相比,模型组、蛭龙组和雷帕组分别在大鼠局灶性脑缺血2小时再灌注损伤后的3小时或12小时检测到了LC3-Ⅱ蛋白和Beclin1阳性蛋白的表达,并示3小时时就开始增加,直到12小时,而与模型组相比,蛭龙组和雷帕组的LC3-Ⅱ和Beclin1蛋白的表达都显著升高(p<0.01)3.3-MA抑制缺血缺氧诱导自噬。通过免疫印迹法检测和免疫组化检测3-MA预处理后缺血再灌注组的LC3-Ⅱ蛋白与Becin1阳性蛋白的表达,发现在大鼠局灶性脑缺血2小时再灌注损伤后3小时和12小时这两个时间点,两者的表达都降低,与模型组相比,差异有统计学意义(p<0.05)。4.3-MA增加了局灶性脑缺血再灌注损伤。与模型组比较,大鼠短暂性局灶性脑缺血2小时再灌注3小时后,3-MA预干预组不仅显著降低了神经功能评分,且脑梗塞体积比亦较大,差异有统计学意义(p<0.01)。5.雷帕霉素预干预与蛭龙活血通瘀胶囊预处理组间各对应时间点的神经功能评分和脑梗塞体积比间无显著差异(p>0.05)。6.蛭龙活血通瘀胶囊预处理对短暂性局灶性脑缺血大鼠有神经保护作用,能提高其对缺血、缺氧的耐受性。我们通过检测实验大鼠短暂性局灶性脑缺血2小时再灌注3小时和12小时后的LC3-Ⅱ蛋白和becline1阳性蛋白的表达,结果示与假手术组和模型组比较,蛭龙活血通瘀胶囊预处理组中的这两种蛋白均上调了(p<0.01和p<0.05),而与雷帕霉素相比,则两者上调均相当;我们还通过电镜观察实验大鼠局灶性脑缺血半暗带皮质区神经元的形态学改变可见,假手术组的神经元形态正常,有健康的细胞核和线粒体,丰富的内质网,少数溶酶体和少量双膜结构;而在蛭龙组和雷帕组中,再灌注3h的电镜观察中可见含细胞器的自噬体及自噬溶酶体,而模型组及3-MA组则未见自噬体。而与模型组相比,蛭龙活血通瘀胶囊组显著改善了神经功能评分和减少了脑梗塞面积(p<0.01)这些都说明活血通瘀胶囊预处理同雷帕霉素预干预一致,可诱导自噬,有神经保护作用和上调实验大鼠对短暂性局灶性脑缺血再灌注损伤的耐受性。结论:1.本研究表明在短暂的局灶性脑缺血再灌注损伤中,自噬被轻度激活;2.3-MA预处理抑制自噬活性,加剧了脑缺血损伤,增加了实验大鼠的脑梗塞体积比,降低了实验大鼠神经功能评分,使实验大鼠对短暂性局灶性脑缺血再灌注损伤耐受下降;3.雷帕霉素则诱导自噬激活,在一定程度上减轻了脑缺血损伤,降低了实验大鼠的脑梗塞体积比,相对增加了实验大鼠神经功能评分,改善了实验大鼠对短暂性局灶性脑缺血再灌注损伤耐受能力;4.蛭龙活血通瘀胶囊预处理,同样减轻了脑缺血损伤,降低了实验大鼠的脑梗塞体积比,相对增加了实验大鼠神经功能评分,显著增加了短暂性局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠脑缺血半暗带皮质区自噬相关蛋白LC3-Ⅱ和becline1的表达,并在缺血2小时后再灌注3小时时电镜检测到了自噬体,这与雷帕霉素预处理效果相似。5.在实验大鼠短暂性局灶性脑缺血2小时再灌注的12小时内,自噬的活化程度与脑梗塞体积比呈负相关,与神经功能评分呈正相关。这些结果在表明,自噬活化是脑缺血再灌注大鼠脑神经保护作用的基础,而蛭龙活血通瘀胶囊预处理在一定程度上正是通过这个机制通过对实验大鼠的脑神经保护作用来提高其对短暂性局灶性脑缺血再灌注损伤耐受的。
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