摘要
本文内容分为三部分进行介绍： 第一部分 TREM-1通路在脓毒血症中的表达及机制研究 目的：研究 TREM-1分子在脓毒血症各类炎性细胞上的表达及TREM-1通路在脓毒血症发病中的作用机制。 方法：构建 BALB/c小鼠腹腔脓毒血症模型,收获腹腔细胞,应用流式细胞仪检测TREM-1分子在各类炎性细胞上的表达;分离正常小鼠腹腔巨噬细胞,加入铜绿假单胞菌共培养,在培养液中加入 TREM-1融合蛋白封闭 TREM1/DAP12通路,应用瑞氏染色技术检测巨噬细胞吞噬能力变化,应用ELISA技术检测巨噬细胞分泌炎性因子水平变化,应用实时定量 PCR技术检测巨噬细胞表面协同刺激分子表达水平;构建BALB/c小鼠腹腔脓毒血症模型,使用TREM-1融合蛋白及对照 IgG进行治疗,对脓毒血症小鼠生存时间进行统计;构建 BALB/c小鼠腹腔脓毒血症模型,使用TREM-1融合蛋白及对照 IgG进行治疗,24小时后处死小鼠,收获外周血用于分析血清中IL-1、TNF-α、MCP-1等炎性因子水平变化,收获腹腔细胞应用流式细胞仪检测 CD40、CD86等协同刺激分子在巨噬细胞上的表达变化。 结果：TREM-1分子大量表达于小鼠中性粒细胞和巨噬细胞上,而在淋巴细胞上不表达,且在铜绿假单胞菌急性感染引起的脓毒血症模型中,TREM-1分子在巨噬细胞及中性粒细胞上的表达明显增高;使用TREM-1融合蛋白阻断该通路后显著延长脓毒血症小鼠死亡时间;使用TREM-1融合蛋白阻断该通路后在体内外均能显著降低巨噬细胞分泌 IL-1、TNF-α、MCP-1等炎性因子能力,但对巨噬细胞吞噬功能无显著影响;使用TREM-1融合蛋白阻断该通路后在体内外均能显著降低其表面 CD40、CD86等协同刺激分子表达,从而影响巨噬细胞抗原提呈功能。 结论：TREM-1通路表达于脓毒血症相关巨噬细胞与中性粒细胞,阻断该通路可以显著减少巨噬细胞释放 IL-1、TNF-α等炎性因子能力,且显著降低巨噬细胞活化、抗原提呈功能,从而显著降低脓毒血症发生时过度放大的炎性反应,最终明显延长脓毒血症小鼠存活。 第二部分研究Tim-3信号通路和Th17细胞的相关性以及在肺炎克雷伯菌感染引起的肺炎中的作用 目的：研究 Tim-3信号通路和Th17细胞的关系以及在急性肺炎发病时的作用机制。 方法：分离正常小鼠脾脏淋巴细胞,加入特定的细胞因子诱导 T细胞向 Th17细胞分化,一段时间后检测 Th17细胞上 Tim-3分子表达水平,且加入 Galectin-9激活 Tim-3通路后检测 Th17细胞凋亡变化;建立 BALB/c小鼠肺炎克雷伯菌急性肺炎感染模型,使用Galectin-9或对照 PBS治疗急性肺炎小鼠,记录各组小鼠存活时间;建立 BALB/c小鼠肺炎克雷伯菌急性肺炎感染模型,使用Galectin-9或对照 PBS治疗急性肺炎小鼠,不同时间点处死小鼠并收获外周血血清检测 IL-17、IFN-γ、IL-4、G-CSF、MIP-2等细胞因子水平,同时检测脾脏 CD4+及CD8+T细胞绝对值、外周血中性粒细胞绝对值、肺组织内细菌含量等指标变化。 结果：脾脏淋巴细胞经 CD3抗体、CD28抗体、TGF-β、IL-6诱导后明显向 Th17细胞分化,且流式检测结果显示 Tim-3分子在诱导的Th17细胞上大量表达,达到65%;经诱导的Th17细胞加入 Galectin-9激活 Tim-3通路后可以引起 Th17细胞凋亡增加,从而显著降低 IL-17分泌;体内使用Galectin-9融合蛋白治疗肺炎克雷伯菌感染引起的急性肺炎可以加速小鼠死亡,原因可能为使用Galectin-9激活 Tim-3通路后减少IL-17与 IFN-γ水平,从而显著降低 G-CSF和MIP-2分泌。G-CSF和MIP-2分泌减少造成中性粒细胞增殖过少,不足以对抗体内的肺炎克雷伯菌,从而造成大量细菌在肺组织内繁殖,加速肺炎小鼠死亡。 结论：Tim-3分子在 Th17细胞上表达且激活 Tim-3通路同样引起 Th17细胞凋亡。使用Galectin-9激活该通路后可以显著降低体内外 IL-17水平,间接引起中性粒细胞增殖减少,导致大量细菌在组织内繁殖,从而加速肺炎小鼠的死亡。 第三部分 CD4+T细胞、CD8+T细胞及DC细胞通过Tim-3信号通路调节脓毒血症小鼠存活 目的：研究 Tim-3分子在脓毒血症各类炎性细胞上的表达及Tim-3通路调节脓毒血症的作用机制。 方法：构建铜绿假单胞菌腹腔感染引起的BALB/c小鼠脓毒血症模型,收获小鼠腹腔总细胞,使用流式细胞仪检测 Tim-3分子在各类炎性细胞上的表达;构建铜绿假单胞菌腹腔感染引起的BALB/c小鼠脓毒血症模型,给予 Tim-3封闭蛋白或对照 IgG进行治疗,观察各组小鼠存活时间,并定期处死小鼠收获血清检测 IL-1、TNF-α、IFN-γ、IL-4等炎性因子变化;体外分离小鼠脾脏淋巴细胞,加入 LPS进行诱导,加入 Tim-3封闭蛋白阻断该通路,48小时后检测各类炎性因子分泌变化,检测阻断该通路后淋巴细胞增殖、凋亡等功能变化;构建小鼠脓毒血症模型,给予 Tim-3封闭蛋白或对照 IgG进行治疗,检测外周血及腹腔炎性细胞数量及铜绿假单胞菌细菌含量,体内检测淋巴细胞、DC细胞增殖、活化改变,检测巨噬细胞吞噬、凋亡改变。 结果：Tim-3分子在脓毒血症腹腔 CD4+T细胞、 CD8+T细胞、CD11c+DC细胞上表达,而在中性粒细胞、巨噬细胞上不表达,且脓毒血症时 Tim-3分子在腹腔 CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD11c+DC细胞上和正常小鼠相比,表达显著增高,分别达到28%、38%及23%;使用Tim-3封闭蛋白阻断该通路后可以显著降低 IL-1、TNF-α、IFN-γ等炎性因子分泌,从而显著延长脓毒血症小鼠存活;体外使用Tim-3封闭蛋白阻断该通路引起淋巴细胞增殖与活化减少、但凋亡增加;体内使用Tim-3封闭蛋白治疗脓毒血症小鼠同样减少 T淋巴细胞与 DC细胞活化;体内使用Tim-3封闭蛋白治疗脓毒血症小鼠对巨噬细胞吞噬功能无影响,但可以增加趋化至腹腔的巨噬细胞绝对值,减少腹腔细菌含量,同时体内阻断该通路可以减少巨噬细胞凋亡。 结论：Tim-3分子表达于脓毒血症腹腔 CD4+T细胞、CD8+T细胞、CD11c+DC细胞,而在中性粒细胞、巨噬细胞上不表达。阻断 Tim-3通路降低 IL-1、TNF-α、IFN-γ等炎性因子分泌,从而显著延长脓毒血症小鼠存活时间,机制可能为阻断 Tim-3信号通路在体内外减少淋巴细胞与 DC细胞增殖、活化,但增加其凋亡。此外,阻断该通路还可以增加趋化至腹腔的巨噬细胞数量、减少巨噬细胞凋亡。
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