摘要
角毛壳菌（Chaetomium cupreum Ames）是一种优良的生物防治真菌，能有效防治多种植物病原菌引起的病害；几丁质酶是其生防过程中产生并发挥重要作用的细胞壁水解酶类。以角毛壳菌（C. cupreum）几丁质酶为研究对象，构建高效表达几丁质酶的基因工程菌株；并通过密码子改造、多拷贝整合转化子的筛选、发酵条件优化等方法提高了几丁质酶基因在毕赤酵母（Pichia pastoris）系统中的表达量。为几丁质酶工业化生产提供优良的基因工程菌株，为研究和开发新型生物农药奠定坚实的基础。 在模拟自然环境条件下，分别以3种植物病原真菌细胞壁诱导角毛壳菌（C. cupreum）细胞壁水解酶类的产生；半定量RT-PCR分析表明，几丁质酶Chi58基因被诱导表达，推测几丁质酶 Chi58基因可能是角毛壳菌（C. cupreum）几丁质酶系的一个重要组分并参与角毛壳菌（C. cupreum）的生物防治作用。因此，本文通过反向 PCR方法克隆了几丁质酶基因 Chi58全长序列，为角毛壳菌（C. cupreum）的生物防治机理的研究奠定基础。 Chi58基因已成功注册到 GenBank数据库（登录号为：DQ886936），经生物信息学分析表明，CHI58包含1个 N端信号肽序列、1个几丁质结合区（ChBD）、富含半胱氨酸的连接区及糖基水解酶18家族催化区结构域。ChBD与植物几丁质酶中 ChBD的位置及氨基酸组成相似，同属于 ClassI几丁质结合域类型。 构建载体 pYES2-Chi58和 pPIC9K-Chi58分别转化酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）H158及毕赤酵母（P. pastoris）GS115。经酶活性测定表明，在酿酒酵母（S. cerevisiae）表达系统中，几丁质酶活性在诱导后第60h达到最高值，酶活为0.33U；而在毕赤酵母（P. pastoris）中酶活最高值为39U，出现在诱导后第120h，酶活性较酿酒酵母（S. cerevisiae）提高约120倍。 SDS-PAGE及 Zymogram验证了几丁质酶 CHI58被分泌到毕赤酵母（P. pastoris）细胞外大量表达，且具有几丁质酶活性。发酵液中几丁质酶酶促反应最适温度为45℃；最适 pH值为5.8；在70℃下具有较好的热稳定性；转化子经10代传代培养后仍具有较高的几丁质酶活性。几丁质酶对可溶性底物（乙二醇几丁质）及不溶性底物（胶态几丁质、粉末几丁质、羧甲基壳聚糖）降解作用不同，不能降解可溶性的乙二醇壳聚糖。金属离子及化合物可以影响几丁质酶的活性，其中Ba2+和NH4+对几丁质酶活性的影响最大，使酶活性分别提高了171.2%和80%；而 Mg2+和 K+使酶活性分别提高了21.2%和24.4%；其它金属离子及化合物对几丁质酶均具有抑制作用，其中 Ca2+、Mn2+和NaN3对酶活的抑制作用最弱。 分析影响 CHI58在毕赤酵母（P. pastoris）中表达量的内、外因素表明，密码子改造是提高外源基因表达量的最直接有效地方法。将 Chi58基因中相距较近的5个编码精氨酸的密码子 CGC突变为毕赤酵母（P. pastoris）使用频率较高的 AGA后，Chi58在毕赤酵母（P. pastoris）中的表达量提高了约3倍。经密码子改造、多拷贝整合筛选、发酵条件优化后，CHI58的酶活值最高达246.68U，为初始几丁质酶活性的6倍。 通过 SOE-PCR方法获得了几丁质结合域（ChBD）缺失突变体，将缺失突变体在毕赤酵母（P. pastoris）中进行表达，结果表明，ChBD的存在对不溶性几丁质的绑定和吸附具有重要的作用。将缺失突变体的转化子发酵液浓缩10倍进行体外抑菌试验，发酵液对立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）、杨树叶枯病菌（Septoria tritici）及稻瘟病菌（Pyricularia oryzae）具有不同程度的抑制作用，但抑制率较低，最高抑菌率仅为15%；而 Chi58的转化子发酵液浓缩10倍后，最高抑菌率可达40%。由此说明，缺失几丁质结合域的几丁质酶对植物病原菌的抑制作用明显降低，几丁质结合域的存在对几丁质酶的生物防治作用具有重要意义。
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