摘要
目的： 观察清肝方对D-GalN诱导急性肝衰竭热毒血瘀证大鼠肝损伤及肝再生的影响，在此基础上进一步探讨清肝方抗ALF的作用环节及机理。 方法： 选取健康清洁级雌性SD大鼠125只，体重180±20g，随机分为四组，即空白1、2组各10只，模型1、2组，美能1、2组及清肝方1、2组各20、15只。其中，1组用于造模后36h取血及肝组织标本;2组用于观察造模后96h大鼠的生存率。建模前12h禁食，除空白组外，其余各组用D-GalN1.4g/kg单次腹腔注射建立大鼠ALF热毒血瘀证模型;空白组腹腔注射同等剂量的生理盐水。造模前3天至实验结束，每日灌胃1次，空白组和模型组给予蒸馏水10ml/kg/d灌胃，美能组给予成人等效临床剂量15.6mg/kg/d，清肝方组给予成人等效临床剂量29.7g/kg/d。动物自由饮食。以腹腔注射的时间为标准点，造模36h后取1组大鼠，经股动脉取血6ml，其中4ml置于干燥管中，另2ml置于枸橼酸钠抗凝管中，常规分离血清，-20℃冻存待测。断颈处死动物后，沿腹正中线剖开皮肤，分离出肝组织，取肝左叶相同部位存放于10％中性福尔马林液固定，并取肝右叶置于冰块上，以PBS缓冲液清洗干净后，切取1.0cm×1.0cm×0.2cm大小的肝组织1块，置于冻存管中，迅速用液氮速冻后转运至-70℃冰箱备测。主要观察96h内各组大鼠的行为学变化及生存率;全自动生化分析法检测血清ALT、AST、TBi1、ALB及CHE;全自动血凝分析法检测血浆PT;SABC免疫组化法检测肝组织PCNA;RT-PCR荧光法检侧肝组织TLR4、NF-κB、HMGB1及caspase-3mRNA表达水平。 结果： 1、96h生存率:①模型组生存率为33.3％，美能组为46.7％，清肝方组为66.7％，三组的差异无统计学意义(P＞0.05)。②模型组、美能组及清肝方组估计平均生存时间分别为64.6、71.9、83.3h;log-rank检验提示清肝方组累积生存率高于模型组(P＜0.05)，而美能组与模型组、清肝方组差异均无统计学意义(P＞0.05)。 2、肝功能及凝血功能:模型组与空白组、清肝方组相比，在血清ALT、AST、TBiL水平及血浆PT水平方面明显升高，而在血清ALB、CHE水平方面显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05)。美能组仅在ALT、AST及TBiL水平方面与模型组的差异有统计学意义(P＜0.05)。 3、肝组织病理评分:模型组病理损害积分明显高于空白组，而清肝方组及美能组的积分都低于模型组，且清肝方对肝脏病理损害的改善更为明显，差异均有统计学意义(P＜0.05)。 4、RT-RCR检测指标表达情况:空白组肝组织TLR4、NF-κB、HMGB1、caspase-3mRNA表达水平较低，而在模型组中明显表达，差异均有统计学意义(P＜0.05)。应用美能或清肝方后，TLR4、NF-κB、HMGB1、caspase-3的表达量均显著下降，且清肝方组下降幅度大于美能组，差异均有统计学意义(P＜0.05)。 5、肝组织PCNA表达情况:造模后PCNA在肝组织中的表达增加，而给予清肝方或美能灌胃可进一步提高其表达水平，尤其是清肝方的作用明显，差异均有统计学意义(P＜0.05)。 结论： 1、清肝方可显著减轻D-GalN诱导急性肝衰竭热毒血瘀证大鼠肝细胞的损伤，促进肝细胞的再生，改善肝功能及肝脏病理，延长生存时间，降低死亡率。 2、清肝方抗D-GalN诱导急性肝衰竭大鼠模型的可能机制:①通过下调肝组织TLR4表达，阻断由相关病原分子、LPS等激活的TLR4/NF-κB信号通路，减少前炎症性细胞因子的表达，还可影响树突状细胞的成熟，抑制过亢的免疫反应。②降低NF-κB在肝组织中的表达，可减少TNF-α、IL-1、IL-6等信号的过度激活，中断炎症的级联反应。③降低肝组织HMGB1表达水平，可阻断HMGB1/TLR4/NF-κB信号通路。④下调caspase-3的表达水平，可抑制肝细胞的凋亡，还可减少因中性粒细胞侵润而继发的肝细胞坏死。⑤上调肝组织PCNA的表达，调节残留肝细胞的再生，促进肝干细胞的分化，进一步改善ALF大鼠的预后。
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