摘要
脂肪酶是重要的工业酶制剂，在食品、制药、洗涤、合成等领域应用广泛。米黑根毛霉脂肪酶(RML:Rhizomucormieheilipase)已经在结构分析、催化反应、工业应用等多方面得到研究。研究者在上游通过定向进化、蛋白结构分析，在下游通过发酵条件和反应条件的优化提高RML在工业催化反应中的酶活。天然的RML包括信号肽(24个氨基酸)、前导肽(70个氨基酸)，以及成熟蛋白区(269个氨基酸)。成熟蛋白的理论相对分子质量为30KDa左右。本课题的研究对象仅包括前导肽和成熟区。 研究表明很多蛋白酶在真核生物中表达时，一些特异性的位点会被糖基化，这些长短不一的糖链会影响蛋白酶的结构和活性，影响大小与糖基化的位点和糖基化程度有关。本研究将野生型RML在毕赤酵母(PichiapastorisGS115)中表达，其活性为1700U/mg蛋白，是该酶在大肠杆菌中表达的6.7倍。通过Glycomod()查询发现RML前导肽处有两个糖基化位点（第8位和第58位天冬酰胺），为了探索RML在毕赤酵母中表达时前导肽处的糖链对酶结构的影响，设计了三个去除糖基化的突变栋(M1，N8A;M2，N58A和M3，N8A和N58A)，结果证明去掉糖基化之后RML的比活是野生型的2倍，然而去掉RML前导肽位置处的糖基化却不利于前导肽被Kex2蛋白酶切除形成成熟的蛋白，而且发现糖基化有助于RML分泌到胞外。 其次，将RML野生型(WT:WildType)和在大肠杆菌中定向进化产生的4株酶活依次提高的突变株(G1:L57V，G2:L57V/V67A/I111T，G3:L57V/V67A/I111T/S168P，G4:L57V/V67A/I111T/S168P/S65A)基因克隆到pPIC9K中，分别构建了质粒pPIC9K-WT、pPIC9K-G1、pPIC9K-G2、pPIC9K-G3、pPIC9K-G4，经SalI线性化后转入甲醇诱导型毕赤酵母中进行分泌表达。与大肠杆菌宿主不同，RML的4个突变株在毕赤酵母中表达时，酶活性没有呈现依次提高的趋势。研究表明RML在大肠杆菌中定向进化的突变株不适合在真核生物中表达，这可能是因为原核生物和真核生物具有不同的蛋白翻译、修饰、折叠体系，因此原核生物定向进化的规律不适用于真核生物。 然后，为了在酵母中进行RML的定向进化，首先利用α-factor和INU信号肽构建了四个菌株(α-factor+WT+pESC-URA+BY4741、INU+WT+pESC-URA+BY4741、α-factor+WT+pESC-URA+EBY100、INU+WT+pESC-URA+EBY100)实现了RML在酿酒酵母中的分泌表达。但是由于在酿酒酵母中蛋白表达量和酶活力都比较低，因此以毕赤酵母为宿主，对野生型RML进行定向进化，并采用罗丹明平板法进行高通量筛选，筛选到两个突变株8-4和8-15-1，其突变位点分别为R41C、A115V/D313E，均使酶活提高了25％左右。 最后，为了提高RML的发酵产量，本课题使用无机盐培养基采用5L发酵罐对RML进行表达。RML的生产过程分三个阶段:第一阶段，前40h菌体生长阶段，40h之后，发酵罐内甘油消耗完全，OD600达100;第二阶段，40-72h是甘油流加阶段，进一步提高菌体量，并为下一步诱导做准备，此阶段结束时OD600达320;第三阶段，蛋白诱导阶段，72h后菌体不再生长，达到稳定期，开始进行甲醇流加诱导蛋白产生，开始诱导时甲醇流加速度为1mL/min，流加10min，2-4h之后根据需要提高甲醇流加速度。132h之后测得菌OD600为300，蛋白浓度为0.375mg/mL，其活性达到233U/mL。 本研究从上游分子改造到下游RML的发酵生产做了一系列的研究，为RML走向工业化生产奠定了坚实的基础。
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