摘要
脱落酸(ABA)对植物的整个生长发育过程中和植物应对各种生物和非生物胁迫都起重要作用，NADPH氧化酶已被证实是ABA诱导ROS产生的主要来源，ROS的大量产生会引起植物体内ABA含量的升高，从而介导ABA信号通路。 植物NADPH氧化酶基因是个多基因家族，不同的rboh基因的组织分布、基因表达情况都不相同。从不同植物中克隆新的rboh基因将有助于更多的了解其表达调控的信息。然而，对于水稻叶片中rboh基因的研究报道很少。 本研究以水稻叶片为材料，对水稻NADPH氧化酶基因（OsrbohA-I）进行了分析、克隆、瞬时表达载体的构建，及OsDMI3和水稻锌指蛋白基因ZFP36对Osrbohs基因的表达调控。主要结果如下: 前期生物信息学研究发现，在水稻基因组的9个Osrbohs基因（OsrbohA-I）中，OsrbohA、B、C、E、I与拟南芥中的AtrbohD和AtrbohF，玉米中的ZmrbohA-D同源性较高。本文以100μmol·L-1ABA活体处理水稻，运用实时荧光定量PCR(qPCR)技术，检测水稻叶片中Osrbohs基因的表达情况。实验结果显示，OsrbohI和OsrbohE基因受ABA诱导表达上调，呈现双峰:OsrbohB在30min时基因表达达到一个高峰，在90min时有一个低峰;OsrbohE在90min时有一个高峰，在45min时有一个相对较低的峰。 以水稻叶片RNA为模板，通过RT-PCR方法扩增OsrbohB和OsrbohE完整的基因编码区。并将OsrbohB和OsrbohE全长基因构建到原生质体瞬时表达载体pXZP008上，得到重组表达载体pXZPOsrbohB和pXZPOsrbohE。用于课题组后期实验。同时，利用激光共聚焦对OsrbohB和OsrbohE基因进行亚细胞定位，发现Osrbohs家族基因定位在细胞膜上。 对OsDMI3突变体中OsrbohB和OsrbohE基因的表达进行检测，并检测ABA加入后OsrbohB和OsrbohE基因表达量，结果发现，OsDMI3突变体中OsrbohB和E基因表达量均有所下降，且经ABA处理后恢复到了对照的水平。同时，利用水稻原生质体瞬时表达体系过表达OsrbohE基因，实验组并用ABA处理，结果表明，过表达OsrbohE以后OsDMI3基因的表达量上升，且ABA处理后表达量更高。利用RNA干扰技术对OsrbohE进行基因沉默，观测OsDMI3基因的表达，结果发现，虽然OsrbohE沉默后基因表达量下降，但加入后的表达水平没有恢复到对照水平。实验最后在水稻OsDMI3突变体植物原生质体中回补OsDMI3过表达质粒，结果发现，在OsDMI3突变体植物原生质体中加入OsDMI3过表达质粒，OsrbohE基因表达量回升，并且经ABA处理后表达上调。此外，实验发现在ZFP36的过表达植株中，OsrbohB和OsrbohE基因的表达量相对野生型均有提高，而在ZFP36的干扰植株中，OsrbohB和OsrbohE基因的表达量相对野生型均有下降。 以上结果分析说明，ABA能诱导OsrbohB和OsrbohE基因的转录，该基因转录和OsDMI3、ZFP36之间存在交叉谈话（crosstalk）;ABA途径中可能存在一个与Osrbohs基因转录相关的正放大环路和反馈调节。
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