摘要
增生性瘢痕是人体创伤修复过程中的产物，其主要成分是纤维蛋白，若纤维蛋白过度生长，则会形成增生性瘢痕(hypertrophicscar)。在我国，有91.4％的烧烫伤病人及44.6％的手术病人在康复阶段会形成增生性瘢痕，并且我国每年约新增3275万增生性瘢痕病人[1，2]。因此，对增生性瘢痕机制的研究和寻找安全有效的天然药物迫在眉睫。 本研究从上海长海医院烧伤科获取增生性瘢痕皮肤组织，采用组织块培养法培养出真皮成纤维细胞，给予齐墩果酸（Oleanolic acid，OA）处理后，进行以下5个方面的研究:(1)人增生性瘢痕成纤维细胞(Hypertrophic Scar Fibro blast s，HSFBs)凋亡的检测:MTT方法检测细胞活力;OA对细胞形态的影响;Hoechst33258染色测定细胞凋亡DNA碎片。(2)检测其凋亡相关蛋白及基因的表达:westernblot方法检测ERK1/2，JNK，p38等蛋白及其磷酸化的表达，FQ-PCR方法检测caspase-3，caspase-8，caspase-9等凋亡相关基因mRNA的表达。(3)信号转导通路的研究:分别以p38MAPK和JNK信号转导通路特异阻断剂SB203580、SP600125阻断信号通路后，再用OA作用成纤维细胞(Fibroblasts，FB)，观察药物对细胞活力及ERK1/2、JNK、p38等蛋白及其磷酸化的影响。(4)OA作用后，对下游凋亡蛋白分子Cyt-c、AIF、Bad和Bax线粒体转位，Bid的裂解，和抑凋亡蛋白分子Bcl-2和Bax等表达的影响，按照ELISA试剂盒说明书分离细胞质和线粒体，westernblot方法检测各蛋白水平。(5)OA对兔耳增生性瘢痕的治疗作用研究:通过建立兔耳模型，对瘢痕形成九个关键的生化指标、胶原纤维的显微观察以及瘢痕增生指数等几个方面考察了OA对瘢痕的抑制作用。 结果表明，(1)用0、2.5、5、10、20、40、80μg/mLOA处理人增生性瘢痕成纤维细胞12，24和48h后，MTT细胞活力检测发现10、20、40、80μg/mL对HSFBs细胞活力有较好的抑制作用，且呈剂量和时间依赖性;对细胞形态影响的结果表明，OA能引起细胞由长梭形逐渐变为圆形，且细胞体积变小，细胞周围轮廓也逐渐变得昏暗;10、20、40μg/mL齐墩果酸处理HSFBs12h后，Hoechst33258染色测定细胞凋亡DNA碎片，结果显示OA能促进细胞DNA的碎裂，形成凋亡小体，引起细胞的凋亡。(2)HSFBs用2％FBS培养基培养6h，给0、20、40μg/mLOA治疗1h后，westernblot方法检测ERK1/2、JNK、p38等蛋白及其磷酸化的表达，p38和JNK蛋白的磷酸化被激活，但不影响ERK蛋白的磷酸化表达;HSFBs用0、10、20、40μg/mLOA处理6h，检测caspase-3/9mRNA及Apaf-1mRNA的表达，结果表明OA促进细胞凋亡蛋白Caspase-3/9mRNA及Apaf-1mRNA的表达，从而促使细胞凋亡，并呈剂量依赖性。(3)信号转导通路的研究:20μM的SB203580或SP600125预处理1h，20μg/mLOA治疗1h，Westernblot结果表明，在相关的信号通路阻断后，OA促进相关通路蛋白磷酸化的作用显著受到抑制。(4)10、20、40μg/mLOA处理12h，线粒体细胞色素c(Cytochrome-c，Cyt-c)、凋亡诱导因子AIF(Apoptosis-InducingFactor，AIF)和Bad含量显著减少，胞浆Cyt-c、凋亡诱导因子AIF和Bad显著增加;并且总的促凋亡蛋白Bax表达显著增加和抗凋亡蛋白Bcl-2表达显著减少，且Bax/Bcl-2的比率上升，且Bid蛋白的表达显著提高。10、20、40μg/mLOA处理6h后，胞浆Bax蛋白表达显著减少，线粒体Bax蛋白表达显著增加。(5)在兔耳瘢痕模型实验中，OA能显著下调MMP-1，TIMP-1，P311及TGF-β1，上调MMP-2，caspase-3，caspase-9等mRNA表达，下调TGF-β1蛋白表达，抑制瘢痕增生指数，减少胶原细胞，增加胶原纤维的疏松度。 综上，OA对人增生性瘢痕成纤维细胞具有显著的抑制作用，齐墩果酸能激活p38和JNK蛋白的磷酸化，但不影响ERK蛋白的磷酸化。OA不拮抗p38通路阻断剂(SB203580)对P-p38的抑制，但增强P-JNK的表达。JNK通路阻断剂(SP600125)阻断后，P-JNK信号被抑制，但OA能促进P-p38蛋白的表达。OA促进Bax的转位，线粒体Cyt-c和AIF的释放，Bax的表达，降低Bcl-2蛋白的表达，从而升高Bax/Bcl-2的比值，促进Apaf-1和capase-3，-9mRNA的表达。兔耳瘢痕模型实验也表明OA能下调MMP-1，TIMP-1，P311及TGF-β1，上调MMP-2，caspase-3，caspase-9等mRNA表达，下调TGF-β1蛋白表达，抑制瘢痕增生指数，减少胶原细胞，增加胶原纤维的疏松度。OA通过激活p38和JNK通路和线粒体死亡途径从而诱导细胞凋亡，是较好的治疗增生性瘢痕的天然药物。
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