摘要
卵黄蛋白(vitellin,简称Vn)是所有卵生的脊椎动物和无脊椎动物雌性卵黄的主要成分,是一种高密度糖脂蛋白,是胚胎和幼体早期发育主要的营养来源,并具有携带转运脂肪的功能。主要是外源合成的前体分子--卵黄蛋白原(Vitellogenin,Vg)修饰而来,是卵生长发育的营养物质。近年来,甲壳动物Vg合成位点以及表达量变化的研究成为了热点。目前,在经济类甲壳动物中,卵黄蛋白原的研究主要集中在虾类,关于蟹类的并不多见。中华绒螯蟹(Eriocheirsinensis)作为我国最重要的经济甲壳类之一,其卵黄蛋白的合成、集聚、多寡、分布等等对其胚胎和幼体至关重要。而关于中华绒螯蟹卵黄蛋白的相关报道多停留在卵黄的形成和发生的形态学观察,对于其cDNA序列及其结构预测和功能分析以及表达研究则尚未见报道,本实验选择中华绒螯蟹为研究对象,旨在克隆中华绒螯蟹卵黄蛋白原基因cDNA全序列和对其进行结构预测分析,并通过半定量PCR、实时荧光定量PCR、Northern杂交三种技术对其卵黄蛋白原的合成部位以及在卵原细胞期、初级卵母细胞小生长期(简称小生长期)、初级卵母细胞大生长期(简称大生长期)、成熟前期和成熟期的mRNA表达量进行研究分析。 实验中通过RT-PCR,RACE等技术克隆得到中华绒螯蟹卵黄蛋白原的cDNA序列全长,其长度为7921 bp,软件分析后知其含有一个7689 bp的开放阅读框,其5’和3’的非翻译区分别为28 bp和204 bp;将其开放阅读框翻译为氨基酸序列后进行BLASTP,与其他已知的甲壳类卵黄蛋白原序列间存在33--77%的相似性。对该序列进行结构分析,进化树结果表明中华绒螯蟹与其它四种蟹类间呈现较远的亲缘关系,预测该序列编码一个含2562个氨基酸残基的蛋白质,可能含有2个结构域:参与脂质转运的卵黄蛋白原N端结构域(Vitellogenin_N);以及血管性血友病因子(von Willebrand factor)D型结构域(VWD)。加上蓝蟹、三疣梭子蟹、拟穴青蟹、锈斑蟳共5种蟹中,该蛋白的三级结构含有氢键(H-bond)、α螺旋(Helices)、β折叠链(strands)和β转角(Turns)四要素,且在数量上相差不大,因此,我们能进一步推断,在胚胎发育及早期幼体发育时期,它们对于个体的生长发育繁殖均有类似的功能和作用。对该蛋白的跨膜结构域进行预测分析结果表明,中华绒螯蟹和蓝蟹的Vg蛋白存在膜外到膜内和膜内到膜外的结构,另外3种蟹仅含有从膜内到膜外的结构,这表明在5种蟹中Vg的膜内外运输模式存在差异,含有两种膜内外结构的Vg可能更有利于其膜内外运输,这可能与其繁殖发育的生物学功能有关。 本研究本文运用半定量、实时荧光定量PCR以及Northern杂交的方法,发现卵巢和肝胰腺均是Vg的合成位点,证实对于十足目甲壳动物,卵黄的发生存在双源,即除了卵子本生通过卵内合成(autosynthesis)外,肝胰腺作为卵巢外组织合成Vg。推断中华绒螯蟹Vg的外源性合成始于肝胰腺,随血液循环进入卵巢,在卵母细胞中积累。从总体上看,Vg在肝胰腺中的表达量远远高于卵巢,说明在中华绒螯蟹生长发育过程中,相对于卵巢,作为甲壳动物消化、代谢器官的肝胰腺是表达Vg的主要器官,它间接参与了中华绒螯蟹发育生殖过程。另外,本实验表明肝胰腺的Vg表达高峰期比卵巢要出现得晚,该结论与其他甲壳类动物有所差异。 三种实验结果均表明,在中华绒螯蟹发育的卵原细胞期、初级卵母细胞小生长期、初级卵母细胞大生长期(简称大生长期)中,Vg mRNA表达量呈上升趋势,荧光定量PCR结果表明,卵巢中五个时期Vg mRNA表达量均存在显著性差异(P<0.05),肝胰腺中除了成熟前期和成熟期外,其他时期彼此间均存在显著性差异(P<0.05)。荧光定量PCR和RT-PCR的卵巢和肝胰腺研究结果以及荧光定量PCR的肝胰腺研究结果表明,中华绒螯蟹成熟前期中肝胰腺Vg mRNA表达含量明显下降,这与该时期环境温度大幅度下降有关;随着人们对Vg研究的不断深入,研究方法越来越多,各种方法对于同一实验研究结果也不尽相同,利用各种方法的优势来研究实验结果,可以从多方面分析比较,获得更为准确的实验结果,更准确地阐述卵黄合成机理,从而更有助于人们对于十足目甲壳动物Vg的研究。
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