摘要
研究目的： 利用载脂蛋白E(Apolipoprotein E,ApoE)基因敲除小鼠,予以高脂饲料喂养,构建动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)模型。探讨在AS形成过程中,缝隙连接蛋白37(connexin 37,cx37)、缝隙连接蛋白40(connexin 40,cx40)和缝隙连接蛋白43(connexin 43,cx43)表达的改变情况。 研究内容和方法： 1、构建小鼠AS模型 40只4周龄体重在18-22g雄性SPF级C57BL/6J载脂蛋白E基因敲除小鼠为实验组(AS组),40只相同周龄及体重范围的雄性SPF级C57BL/6J小鼠为对照组(control组)。两组小鼠正常饲料喂养至8周龄时,将饲料更换为高脂配方(1%胆固醇+15%猪油)。 分别在在高脂饲料喂养0、4、8、12周后,收集实验标本。小鼠麻醉后,摘除眼球取血,分离血浆行血脂四项检查,分离PBMC并提取蛋白后冻存。用含肝素的冷PBS灌注冲洗左侧心腔及动脉腔内的残血后,换用冷多聚甲醛溶液继续灌注,充分固定后,在解剖显微镜下小心剥离血管外周脂肪组织。 小鼠血管大体标本行苏丹IV染色以观察内膜脂纹形成情况。分别将分离出的主动脉升段、主动脉弓、胸主动脉行石蜡切片,HE染色镜下观察血管形态判断ApoE基因敲除小鼠AS模型是否构建成功。 2、观测AS病程中,动脉血管内皮细胞层的改变 将分离得到的小鼠胸主动脉段血管用戊二醛固定,然后行扫描电子显微镜观察血管内皮细胞在正常血管和AS病变处的形态学改变;用激光共聚焦显微镜检测血管内皮细胞间缝隙连接蛋白所发出的的荧光信号。观察血管内皮细胞及其间隙连接蛋白在AS病程中的改变情况。 3、检测AS病变处,CXs表达定位的改变情况 主动脉段蜡块切片后,应用免疫组化技术检测血管壁AS斑块病变处,cx37、cx40、cx43的表达。探讨AS斑块内CXs表达的改变情况。 4、检测AS病程中,血管壁CXs表达的改变情况 小鼠胸主动脉血管的蜡块,切片后,应用免疫组化技术检测非AS斑块病变处血管壁cx37、cx40、cx43的表达。 5、外周血单个核细胞缝隙连接蛋白CXs的表达 将收集到的PBMC蛋白行蛋白免疫印迹法检测,以观察外周血单个核细胞cx37、cx40、cx43的表达。探讨AS外周血单个核细胞是否存在CXs表达的改变。 研究结果： 1、小鼠AS模型的评价 1.1、体重变化:高脂饲养前后,AS组和control组小鼠体重在各个时间点无差异。(P>0.05)。 1.2、血脂变化:AS组小鼠的TC和LDL较control组在各个时间点上均明显升高(P<0.01)。TG和HDL在两组动物间无差异。 1.3、苏丹IV染色:AS组主动脉内膜斑块状隆起处被染成猩红色,无斑块处呈现内膜本色,红白分明;control组主动脉内膜光滑,无着色呈现内膜本色。表明AS组小鼠血管大体标本上出现明显的AS斑块。AS病变最先出现在主动脉根部,其次为主动脉弓部和动脉分叉处,随后在胸主动脉段也可观察到AS病变。 1.4、HE染色:AS组主动脉内膜明显增厚,可见脂质斑块形成,斑块内有大量脂肪细胞,泡沫细胞,管腔明显狭窄;control组主动脉内膜光滑、完整、无增厚,内皮下无脂质沉积。 综上结果:显示该模型指标符合动脉粥样硬化的表现,AS模型构建成功。 2、血管内皮细胞层在AS病变过程中的改变 扫描电子显微镜显示:正常小鼠胸主动脉血管内皮细胞较扁平,大多呈梭形,其间夹杂有少许呈条索状,其长轴均与血流方向一致。AS小鼠的血管内皮细胞,可观察到明显的增生肿胀,呈灶性病变,继而内皮细胞发生融合,形成条束状或小团块;主动脉内膜表面的小斑块可逐渐增大、变厚、相互融合成较大的斑块。 激光共聚焦显微镜检测示:小鼠胸主动脉血管内膜上,cx37和cx40在内皮细胞表达,当其表达量较高时,可通过cx37和(或)cx40的点状荧光信号轻易的识别出每个内皮细胞的完整轮廓。control组小鼠血管内皮细胞的cx37和cx40表达量较AS组高。本次试验无法检测到cx43在小鼠胸主动脉内皮细胞层上的表达。 3、AS斑块病变内CXs的表达 免疫组织化学检测示:CD31在血管腔面和斑块表面呈线性表达,表明AS斑块病变处拥有完整的内皮细胞覆盖。cx37可在斑块表面的内皮细胞,脂质核的巨噬细胞和斑块底部广泛表达,cx43也可在斑块表面的内皮细胞,斑块底部的平滑肌细胞上有一定程度的表达。 4、AS病程中,血管壁CXs的表达(免疫组织化学检测) cx37在血管壁的表达,AS组与control组在各个时间点上的差异均无统计学意义(P>0.05)。AS组小鼠血管壁SMC层的cx37表达呈上升趋势,在第4～8周升高较明显(卡方检验:F=13.946,P<0.05;组间两两比较,0周、4周vs8周、12周的P<0.05)。control组小鼠血管壁SMC层的cx37的表达也呈上升趋势,但差异无统计学意义(秩和检验:P>0.05)。 cx40在两组动物不同时间点的比较,差异均无统计学意义(P>0.05;卡方检验:AS组F=3.051,P>0.05;control组F=3.343,P>0.05;两两组间对比均无统计学意义)。 cx43在两组动物呈低表达或无表达。 5、AS外周血单个核细胞CXs的表达(蛋白免疫印迹技术) cx37在PBMC的表达,在整个饲养周期的各个时间点上,AS组均明显低于control组(P<0.01)。AS组小鼠PBMC的cx37表达呈下降趋势(F=84.913,P<0.05);control组小鼠PBMC的cx37表达较稳定(F=0.901,P>0.05)。 cx40在PBMC的表达,在整个饲养周期的各个时间点上,AS组均明显低于control组(P<0.05),但两组小鼠PBMC的cx40表达在整个饲养周期中均无明显变化(卡方检验:AS组F=2.672,P>0.05;control组F=2.68,P>0.05。) cx43在两组动物PBMC的表达,在整个饲养周期的各个时间点上,均无明显变化,差异均无统计学意义。(卡方检验:AS组F=2.55,P>0.05;control组F=3.858,P>0.05。) 结论： 1、cx37在血管壁全层、AS斑块内部和PBMC广泛表达,且在不同时期存在改变,因此,cx37在AS病程中的作用应当引起更多的重视。 2、cx40虽然也同时在血管壁和PBMC表达,但其表达量较小,也未见表达量随AS病程改变的趋势,可能cx40对AS的影响有限。 3、cx43的表达范围较小,仅在PBMC检测到了cx43的恒定表达,我们得到的信息较少,尚不足以推测cx43在小鼠AS中的作用大小。
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