摘要
三叶因子家族（Trefoil factor family, TFF）是一群分子量为12-22KD、主要表达于粘膜上皮、发挥增强上皮细胞防御及促进粘膜修复重建的小分子多肽，这种作用有别于其他具有粘膜保护功能的小分子多肽，证明三叶三叶因子家族在粘膜保护中发挥独特作用。在胃肠道中，三叶因子1大量表达于包括胃小凹在内胃粘膜上皮细胞，在十二指肠布氏腺体低表达。在基因敲除TFF1小鼠模型胃粘膜癌变及在近50％人类胃癌中下调表达证明TFF1可能是胃癌抑癌基因。在炎症及胃肠道损伤情况下TFF1与三叶因子家族其他成员经自分泌或旁分泌的形式上调表达，通过诱发上皮细胞迁移及避免迁移过程中失巢凋亡维持上皮细胞连续性。除了上皮细胞受损及消化道炎症刺激下TFF1瞬时增高表达外，在多数肿瘤乳如结肠癌、肺癌、胰腺癌、前列腺癌、乳腺癌等均可发现TFF1高表达。在正常情况下TFF1不表达的组织中发生肿瘤后出现TFF1广泛表达证明其在肿瘤发生发展过程可能具有重要作用。 第一部分 PIEZO1与TFF1结合作用的验证 目的:确认PIEZO1与TFF1结合作用及结合位点。 方法:选用TFF1内源性高表达GES-1细胞行免疫共沉淀分析确定PIEZO1与TFF1结合作用。同时构建带HA标签TFF1-3表达质粒转染至GES-1细胞，细胞裂解液经与HA偶联琼脂糖珠免疫沉淀后用Piezo1抗体行Western Blot检测。GES-1细胞中转染TFF1-HA表达质粒后经Piezo1、HA抗体及荧光二抗孵育后行激光共聚焦检测。构建3种带MYC标签截短型Piezo1表达质粒Piezo1-N(1-730氨基酸)、Piezo1-M(731-1984氨基酸)、Piezo1-C（1985-2566氨基酸），分别与TFF1-HA质粒转染至293FT细胞，细胞裂解液经与HA偶联琼脂糖珠免疫沉淀后用MYC抗体行Western Blot检测。 结果:GES-1细胞裂解液经TFF1抗体免疫沉淀后可检测到特异性Piezo1条带。在分别转染HA标签TFF1-3表达质粒的GES-1细胞裂解液经HA抗体免疫沉淀后，只有转染TFF1-HA能检测到Piezo1条带。TFF1与Piezo1在GES-1细胞胞浆中有共定位现象。3种MYC标签截短型Piezo1质粒分别与TFF1-HA转染至293FT细胞经HA抗体免疫沉淀后，只有转染Piezo1-C能检测到阳性条带。 结论:TFF1与Piezo1存在结合作用，结合位点位于Piezo1蛋白C端。 第二部分 Piezo1在胃癌组织中表达检测及对胃癌细胞抗凋亡能力的影响 目的:明确Piezo1在胃癌组织及癌旁正常组织中表达有无差异及干扰Piezo1后对胃癌细胞株SGC-7901抗凋亡能力的影响。 方法:实时定量PCR检测胃癌组织及癌旁正常组织中Piezo1 mRNA水平表达差异。在SGC-7901细胞中稳定干扰Piezo1的表达，通过流式细胞技术检测细胞抗凋亡能力的变化。 结果:在胃癌组织及癌旁正常组织中，Piezo1表达水平无明显差异。SGC7901细胞中稳定干扰Piezo1表达后增加细胞抗凋亡能力(P＜0.05)。 结论:Piezo1的表达在胃癌组织及癌旁正常组织中无差异。干扰Piezo1后可增加细胞抗凋亡能力。 第三部分干扰Piezo1抑制TFF1促细胞迁移作用 目的:明确Piezo1与TFF1相互作用对胃癌细胞迁徙作用的影响。 方法:分别构建BGC-823及SGC-7901稳定干扰Piezo1细胞株及对照细胞株，在干扰基础上再二次筛选过表达TFF1细胞株及对照细胞株，构建四种细胞株:过表达TFF1细胞株(pU6-TFF1)，干扰Piezo1细胞株(siPiezo1-HA)，对照细胞株(pU6-HA)以及干扰Piezo1+过表达TFF1细胞株(siPiezo1-TFF1)。两类细胞四种细胞株分别行划痕与Transwell实验，并行Western-Blot检测integrinβ1，β5，α1及E-cadherin/β-catenin表达改变。 结果:成功构建过表达TFF1细胞株(pU6-TFF1)，干扰Piezo1细胞株(siPiezo1-HA)，对照细胞株(pU6-HA)以及干扰Piezo1+过表达TFF1细胞株(siPiezo1-TFF1)。划痕实验结果示干扰Piezo1表达后显著减弱细胞迁移能力(SGC-7901: siPiezo1-HA55％±12％ compared with pU6-HA100％±14％; p＜0.05; BGC-823: siPiezo1-HA43％±15％ compared with pU6-HA100％±17％; p＜0.01）及TFF1过表达引起的促迁移作用，(SGC-7901:siPiezo1-TFF174％±15％ compared with pU6-TFF1143％±12％; p＜0.05; BGC-823:siPiezo1-TFF155％±17％ compared with pU6-TFF1132％±30％; p＜0.05)，干扰Piezo1后可显著减低TFF1引起促迁移作用(SGC-7901:siPiezo1-TFF174％±15％ compared with siPiezo1-HA55％±12％; p＞0.05;BGC-823:siPiezo1-TFF155％±17％ compared with siPiezo1-HA43％±15％; p＞0.05).Transwell实验也得到类似结果。Western Blot示干扰Piezo1后可减少integrinβ1表达，过表达TFF1后可增加integrinα1表达，干扰Piezo1及过表达TFF1对E-cadherin/β-catenin表达无显著影响。 结论:Piezo1对细胞迁移具有重要作用，干扰Piezo1后可抑制TFF1过表达引起的促迁移作用。
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