摘要
1.目的: 多年来，中药质量控制多借鉴化学药品质量控制模式来进行指标成分的检测。而中药及其制剂的化学成分复杂，很难用其中个别成分的药理作用来阐明其疗效，且部分中药指标成分的对照品存在价格昂贵、研制困难、分离难度大、个别单体化合物不稳定等问题。因此需要寻求一种新的思路、建立新的检测方法，减少对照品的使用或改变对照品的获得途径。用对照提取物来替代对照品，从单一对照品分离变为混合对照品分离是一种可行的方法。本文以黄柏为对象，研究其对照提取物的制备工艺和质量标准;建立以黄柏对照提取物为对照的多成分含量测定方法，同时开展以一种化学对照品（盐酸小檗碱）为对照的多成分含量测定方法的比较研究，寻求新的质量评价模式，为黄柏药材的质量控制提供技术指导和依据。 2.方法: (1)采用HPLC法同时测定黄柏药材中黄柏碱、小檗碱的含量，并进行系统的方法学考察和验证，将结果与药典单一成分测定法相比较。 (2)采用醇提法从黄柏中提取总生物碱，并采用单因素试验和正交设计试验，以黄柏碱、小檗碱含量为指标对黄柏的药材粒度、乙醇浓度、乙醇用量、提取时间和提取次数进行提取工艺考察;以沉淀法、溶剂法及柱色谱分离法对醇提物进行纯化工艺研究，重点比较了大孔树脂、阳离子交换树脂、聚酰胺树脂三种不同方法对生物碱醇提取物的纯化效果;纯化物采用反相填料分离除盐。确定并验证了总生物碱提取纯化工艺。 (3)研究黄柏对照提取物的性状、溶解性、水分等理化特征;建立薄层鉴别方法并考察不同展开系统;优化HPLC法测定黄柏碱、小檗碱的含量，建立黄柏对照提取物HPLC指纹图谱。 (4)建立以黄柏对照提取物为对照的药材含量测定法。进行系统方法学考察，包括线性关系、定量限试验、精密度试验、重复性试验、稳定性试验、加样回收率试验以及耐用性试验。同时对不同批次黄柏药材进行含量测定，通过与药典单一对照品测定法比较，探究对照提取物法在黄柏药材含量测定及质量控制中的适用性和可行性。 (5)以小檗碱为内参物，采用HPLC法计算小檗碱与黄柏碱的相对校正因子，考察3种不同品牌色谱柱、2种不同厂家高效液相色谱仪和2个不同实验室对黄柏中2种成分相对校正因子和待测组分色谱峰定位的影响。采用本方法对不同批次黄柏药材进行含量测定，并与常规外标测定法进行比较，探讨一测多评法的可行性。 3.结果: (1)采用本文建立的HPLC法同时对26批黄柏药材中黄柏碱、小檗碱2种成分进行含量测定，与药典单一成分测定法结果比较无统计学差异。说明该方法适合黄柏中这两种生物碱成分的同时测定。 (2)黄柏对照提取物的最优提取纯化工艺为:用8倍量的70％乙醇对黄柏最粗粉提取2次，每次1.5小时。醇提液加聚酰胺拌样，上聚酰胺柱纯化，再用0.05％HCl水溶液洗脱，洗脱液用NaOH调pH至中性，浓缩，上MCI柱水洗脱盐，用甲醇洗脱，结果纯化后的提取物中黄柏碱与小檗碱总含量为66.79±2％。 (3)黄柏提取物理化特征为:黄色粉末，微解于甲醇，极微溶解于氯仿、丙酮;含水量为5.2％。采用硅胶G薄层板，对提取物以三氯甲烷-甲醇-水(30∶15∶4)为展开剂，喷以碘化铋钾溶液显色，置紫外灯(365nm)下可检视到小檗碱、黄柏碱斑点。HPLC法含量测定条件具有较好的耐用性，所测得结果批间含量差异较小，表明黄柏提取物提取工艺稳定。HPLC指纹图谱研究结果表明不同批次的黄柏提取物样品相似度均≥0.997，制备工艺具有较好的重复性和可行性。 (4)使用以黄柏对照提取物为对照的药材含量测定法和药典单一成分测定法同时对26批黄柏药材进行含量测定，以One-way ANOVA方差分析比较两种方法的结果，结果无统计学差异。说明该方法适合黄柏药材中小檗碱、黄柏碱2种成分的同时测定，可解决黄柏碱对照品售价较高且供应少的困难，同时简化实验操作。 (5)校正因子的重现性考察RSD＜5％，说明本实验计算所得的校正因子重现性良好，可以作为稳定的参数运用于黄柏的含量计算中。各待测组分色谱峰保留时间差或相对保留值RSD均＜5％，可以通过保留时间差和相对保留值作为定位标准对色谱峰进行定位。方法学考察结果表明以小檗碱为对照的药材含量测定法满足定量分析要求。用本法对26批黄柏药材进行含量测定，与常规的外标法测定结果比较相对误差＜1％，说明一测多评法适合黄柏药材中小檗碱、黄柏碱2种成分的同时测定。 4.结论: 本文通过考察黄柏对照提取物的提取和纯化工艺确定了黄柏对照提取物的制备工艺，重复并放大工艺结果证明其具有较好的重复性和可行性。对制备的黄柏提取物进行了理化鉴别、薄层鉴别、定量分析和指纹图谱的研究，并制定了相应的质量标准。建立了以黄柏对照提取物为对照的药材含量测定法，测定26批黄柏药材中黄柏碱和小檗碱含量，与药典单一对照品测定法比较，结果均无统计学差异。以一测多评法对黄柏的2种生物碱成分含量进行测定，与常规的外标法所测结果相比较能满足定量要求。研究结果表明以黄柏对照提取物为对照建立的药材含量测定法和一测多评法均适合同时测定黄柏中的黄柏碱和小檗碱含量。
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