摘要
DDR2（DiscoidinDomainReceptor2）是一种广泛分布高度保守的受体型酪氨酸激酶，是其配体为天然纤维性胶原（I～III型）。DDR2主要表达于胚胎、脑组织、以及延展性强易增生的组织器官如肝脏、皮肤、连接组织等，目前关于DDR2在肿瘤中表达的确切报道仅限于肺癌、鼻咽癌和卵巢癌等几种。由于DDR2的主要功能是促进细胞中MMPs的合成与分泌，因此我们认为肿瘤组织中可能存在这样的病理过程：肿瘤的发生与发展进程中伴随着诸如炎症、低氧等微环境的异常改变，在这些异常改变的影响下肿瘤细胞中DDR2的表达上调，同时实体瘤内部丰富的间质胶原成以及瘤体结构的紊乱为DDR2提供了与其配体相互作用的生理基础，使DDR2能够发生持续活化，进而通过过分泌MMPs以及其它方式推进肿瘤进程。沿着这条思路，我们对DDR2在肿瘤中的作用进行了初步的研究。 我们通过免疫组织化学的方法观察到，乳腺癌病人的组织标本中，DDR2表达阳性，且明显高于乳腺组织良性病变标本。定量PCR和免疫印迹方法检测结果进一步显示，DDR2的mRNA和蛋白水平在乳腺癌组织中均显著高于癌旁组织。然而当我们对多个乳腺癌细胞系的DDR2水平检测后却发现，相比肿瘤组织中DDR2的高表达，细胞系中DDR2水平没有显著增高。这种同一分子在细胞系中与组织中表达不相一致的现象提示我们：DDR2表达水平的变化可能与肿瘤微环境密切相关。 ShyuKG等发现，氧分压的改变能够诱导血管平滑肌细胞中DDR2的表达增高。而低氧状态是实质性肿瘤微环境基本特征之一，同时也是推动肿瘤发生恶性转化甚至转移的关键因素。我们推测，DDR2的水平可能在肿瘤低氧微环境下应激高调进而发挥功能。为了验证上述推测，我们首先给予包括乳腺癌细胞在内的多种肿瘤细胞系低氧及其模拟类似物（CoCl2）刺激，通过检测发现低氧刺激可呈时间依赖性上调肿瘤细胞中DDR2的mRNA和蛋白表达水平，并且这一变化趋势在上皮细胞中尤为明显。这表明肿瘤内部的低氧环境可以诱导DDR2表达增高，低氧与DDR2的表达水平之间存在一定的正相关性。由于之前Barker等人就有报道，DDR家族另一成员DDR1在乳腺癌中可见高表达，因此我们在对DDR2与低氧微环境关系进行研究的同时，也观察了DDR1在低氧条件下的变化，结果发现DDR1并不存在这种低氧诱导特性。这也提示DDR家族的两个成员在肿瘤进程中可能通过完全不同的机制发挥各自的作用。 DDR2作为蛋白酪氨酸激酶受体，发生磷酸化是其进一步发挥功能的基础，因此我们在证实了DDR2表达水平受低氧诱导这一事实的基础上，想进一步明确DDR2的活性是否也受到低氧的影响。从实验结果可以得知，DDR2在其天然配体胶原不存在的情况下，低氧前后磷酸化水平未见明显差异；而当胶原配体存在时，低氧后可见DDR2的磷酸化水平显著增加，并可保持这种活化状态至少48h以上。一方面，这意味着在肿瘤微环境中，低氧仅能诱导DDR2的表达发生改变，而与其活化并没有直接关系。另一方面，这一现象也强烈提示，由于肿瘤间质中存在着大量的胶原成分，能够为低氧条件下高表达的DDR2提供足够丰富的配体以及与配体相互作用的空间可能，从而使具有慢开慢关且活化强度不高等特性的DDR2在低氧诱导的短时高表达之后能发生时间更长、相对强度更大的持续活化效应。 在明确了DDR2具有肿瘤低氧诱导特性这一事实后，这种改变所导致的生物学效应及机制就这成为我们下一步关注的焦点。为有利于深入探讨DDR2低氧诱导的作用，我们设计了针对DDR2的siRNA，并制备相关慢病毒。目前关于DDR2的研究表明，促进细胞增殖以及MMPs的表达分泌并影响细胞的运动能力是DDR2最主要的功能。MTT结果显示，常氧状态下细胞内源DDR2即存在促细胞增殖的作用，低氧条件下DDR2表达水平增高，其促增殖作用更强。此外，在低氧诱导的DDR2影响下，乳腺癌细胞的侵袭力和转移力显著增强。基质金属蛋白酶活性分析结果则进一步说明，低氧条件下肿瘤细胞这种依赖于DDR2表达增高而发生的运动特性改变与促进ECM降解的基质金属蛋白酶MMP-2活性增强密切相关。由此可见，DDR2在肿瘤组织低氧微环境下高表达并持续活化后，通过介导细胞分泌MMP-2，降解细胞间质ECM，以增强细胞运动侵袭能力，进而促进肿瘤细胞恶性转化与肿瘤转移的发生。 上皮细胞向间质细胞转化（epithelial-mesenchymaltransition，EMT）是恶性实体瘤中细胞浸润转移的一个重要途径，在多种肿瘤的原发性浸润和继发性转移中都起着举足轻重的作用，是上皮细胞恶性肿瘤发生与发展的基础。Cannito等人的研究证明，低氧能够通过诱发EMT促进肿瘤细胞恶性转化。那么，低氧诱导DDR2并引发细胞运动能力的改变是否与肿瘤细胞的EMT进程有所关联？基于这个疑问，我们通过形态学观察和标志性分子检测等方法分析了低氧条件下肿瘤细胞的改变。结果显示，乳腺癌细胞MDA-MB-468随着给予低氧时间的延长，细胞间紧密连接逐渐消失，细胞呈现出明显的极性特征，上皮细胞分子标志物E-cadherin等的水平降低，伴随间质细胞分子标志物N-cadherin、Vimentin水平增高，细胞发生EMT改变。而在通过siRNA方法抑制细胞DDR2表达并给予低氧刺激后，细胞EMT改变的形态学与分子学标志均受到明显抑制。结合前面关于DDR2能够促进低氧刺激下细胞运动与侵袭能力增强的实验结果，我们认为活化的DDR2参与了低氧诱导的细胞EMT改变。 通过进一步实验观察发现，这种低氧诱导的EMT过程依赖于DDR2对转录抑制因子Snail及钙粘蛋白E-cadherin的调控。在对肿瘤细胞进行低氧处理并维持胶原刺激后发现，维持上皮细胞特性的重要分子E-cadherin的表达受到抑制；而在低氧与胶原刺激的基础上，对DDR2进行基因沉默后，E-cadherin的表达抑制解除。报告基因检测结果也显示，活化型DDR2对E-cadherin启动子的转录活性有显著的抑制作用，而且这一转录抑制作用是通过增强转录抑制因子Snail的活性而完成的。此外，我们的结果还显示，作为直接参与下调E-cadherin的最重要的转录抑制因子Snail，其表达也与DDR2的水平呈正相关。 综上所述，我们首次发现DDR2在人乳腺癌组织中高表达，并经实验证实肿瘤细胞中DDR2的表达增高具有低氧诱导的特性。首次发现并证明DDR2通过对转录抑制因子Snail及钙粘蛋白E-cadherin的调控参与低氧诱导的细胞EMT改变。
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