摘要
牙周炎是牙周组织的感染性疾病，包括牙周膜，牙骨质，牙槽骨，牙龈的破坏。牙周病治疗的终极目标是阻止进一步的附着丧失和获得牙周软硬组织的再生。近年来，施松涛等发现了牙周膜干细胞，应用牙周膜干细胞治疗牙周病提供了新思路。牙周组织中的炎症变化是否影响其中的干细胞？不同年龄人牙周膜干细胞是否表现不同生物特性？牙根表面和牙槽窝内残留的牙周膜干细胞在分化程度和功能方面是否有所不同？对于这些问题的回答，无疑将有助于更加深入地理解牙周组织的发育过程和牙周炎机理，也将为今后牙周组织再生选择种子细胞打下理论基础。 本课题的研究内容如下： 第一部分：年龄及其微环境对牙周膜干细胞生物特性的影响 目的：探讨年龄及其微环境是否影响牙周膜干细胞的增殖与分化。方法：年轻组牙周膜干细胞与年老牙周膜细胞条件液共培养，年老组牙周膜干细胞与年轻牙周膜细胞条件液共培养，使用倒置显微镜进行细胞形态学观察，使用流式细胞术检测两种细胞的表面分子表达，细胞增殖检测（克隆形成能力及细胞周期分析）、多向分化（成骨和成脂）能力检测、实时定量RT-PCR检测、将细胞与陶瓷骨（CBB）复合，移植入裸鼠皮下6周后取材，组织学观察。结果：流式细胞检测的结果表明，年轻组Stro-1和CD146的表达明显高于年老组，倒置相差显微镜观察年轻组人牙周膜干细胞贴壁伸展后细胞呈长梭形，突起少体积较小，胞体丰满，胞质颗粒少。年老组细胞大多数长梭形,显示较大的伸展形态，胞体不丰满，胞质颗粒多。经年老牙周膜细胞条件培养液诱导的年轻人牙周膜干细胞胞体变长，突起增多。经年轻牙周膜细胞条件培养液诱导的年老人牙周膜干细胞胞体变小，突起减少。年轻组细胞克隆形成能力明显高于年老组。年老牙周膜干细胞条件培养液降低年轻人牙周膜干细胞的克隆形成能力，年轻牙周膜细胞条件培养液提高年老人牙周膜干细胞的克隆形成能力。使用流式细胞仪进行细胞周期分析，年轻组人牙周膜干细胞S+G2M期明显高于年老组，年老牙周膜干细胞条件培养液降低年轻人牙周膜干细胞的细胞周期，年轻牙周膜细胞条件培养液提高年老人牙周膜干细胞的细胞周期。年轻组人牙周膜干细胞体外矿化，成脂能力明显强于年老组。年老牙周膜干细胞条件培养液降低年轻人牙周膜干细胞的矿化结节，脂肪面积，年轻牙周膜细胞条件培养液提高年老人牙周膜干细胞的矿化结节，脂肪面积。年轻组人牙周膜干细胞Runx2，CollagentypeI，Osteocalcin的表达明显高于年老组。年老牙周膜细胞条件培养液降低年轻人牙周膜干细胞成骨相关基因的表达，年轻牙周膜细胞条件培养液提高年老人牙周膜干细胞成骨相关基因的表达。年轻组人牙周膜干细胞移植物显示出在CBB表面有牙骨质和牙周纤维样组织形成，而年老牙周膜干细胞移植物形成的大部分是纤维组织，CBB表面有少量矿化物形成。年轻人牙周膜干细胞经年老牙周膜细胞条件培养液诱导后形成的大部分是纤维组织，CBB表面矿化物很少。年老人牙周膜干细胞经年轻牙周膜细胞条件培养液诱导后在CBB表面形成的矿化组织多于年老人牙周膜干细胞组。 结论：本实验首次在体外模拟牙周膜干细胞发育微环境，年龄影响牙周膜干细胞的增殖与分化，牙周膜干细胞的活性可被外界因素调节。 第二部分：牙周炎症对牙周膜干细胞生物特性的影响 目的：探讨牙周炎症是否影响牙周膜干细胞的增殖与分化。方法：分离、培养健康和牙周炎症感染牙周膜干细胞，使用流式细胞术检测两种细胞的表面分子表达、细胞增殖检测（MTT、克隆形成能力及细胞周期分析）、多向分化（成骨和成脂）能力检测、实时定量RT-PCR检测、ALP活性检测、将细胞与陶瓷骨（CBB）复合，移植入裸鼠皮下6周后取材，组织学观察。结果：流式细胞检测的结果表明，炎症组Stro-1的表达明显高于健康组。炎症组细胞克隆形成能力明显高于健康组。流式细胞检测的结果表明，炎症组人牙周膜干细胞S+G2M期明显高于健康组，健康组人牙周膜干细胞体外矿化，成脂能力明显强于炎症组。健康组人牙周膜干细胞Runx2，CollagentypeI，Osteocalcin的表达以及ALP活性明显高于炎症组。健康组人牙周膜干细胞移植物显示出在CBB表面有牙骨质和牙周纤维样组织形成，牙骨质样细胞陷在矿化结构中；而炎症组牙周膜干细胞移植物形成的大部分是纤维组织，CBB表面有少量矿化物形成。结论：牙周炎症影响牙周膜干细胞在体内和体外的增殖与分化能力。 第三部分：分离部位对牙周膜干细胞生物特性的影响 目的：探讨分离部位是否影响牙周膜干细胞生物特性。方法：分离、培养牙根表面和牙槽窝内的牙周膜干细胞，使用流式细胞术检测两种细胞的表面分子表达、细胞增殖检测（MTT、克隆形成能力及细胞周期分析）、多向分化（成骨和成脂）能力检测、实时定量RT-PCR检测、ALP活性检测、将细胞与陶瓷骨（CBB）复合，移植入裸鼠皮下6周后取材，组织学观察。结果：牙根表面的牙周膜干细胞克隆形成能力明显高于牙槽窝内的牙周膜干细胞。流式细胞检测的结果表明，牙根表面的牙周膜干细胞S+G2M期明显高于牙槽窝内的牙周膜干细胞。牙槽窝内的牙周膜干细胞体外矿化能力明显强于牙根表面的牙周膜干细胞，成脂没有差异。牙槽窝内的牙周膜干细胞人牙周膜干细胞Runx2，CollagentypeI，Osteocalcin的表达以及ALP活性明显高于牙根表面的牙周膜干细胞。牙根表面的人牙周膜干细胞移植物显示出在CBB表面有牙骨质和牙周纤维样组织形成，牙骨质样细胞陷在矿化结构中；而牙槽窝内的牙周膜干细胞移植物形成的大部分是类骨样结构。结论：如果重建牙骨质/牙周膜样结构的话，可以选择牙根表面牙周膜干细胞作为牙周组织工程的种子细胞，如果重建骨样结构的话，最好从选择牙槽窝牙周膜干细胞作为种子细胞。
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