摘要
蛇床子是草本植物蛇床的干燥成熟果实，自然资源十分丰富[1]。其主要药理活性成分是香豆素类化合物，蛇床子素（osthole，OST）即其中香豆素类化合物的主要成分[2]。近期研究发现，蛇床子素具有植物雌激素样作用，且可影响部分酶的活性、蛋白的合成、钠钾ATP酶活性，具有潜在的神经保护作用[3]。Homer1a蛋白可干扰Ⅰ型代谢性谷氨酸受体（metabotropicglutamatereceptorⅠ，mGluR1a）从胞浆内质网到突触后膜的转运及其在突触后膜的定位，并可影响细胞Ca2+通道、Shank、细胞骨架蛋白等的功能，具有神经保护作用。本研究利用离体培养的大鼠皮层细胞氧糖剥夺模型（oxygenglucosedeprivation，OGD）和在体大鼠四血管阻塞法（4-vesselocclusion，4VO）脑缺血再灌注模型，研究蛇床子素后处理在缺血再灌注脑损伤后的脑保护作用及Homer1a在其中的表达情况，旨在阐明蛇床子素的神经保护作用和该药物保护作用的可能的分子生物学机制。 实验一：体外培养大鼠脑皮层神经元氧糖剥夺后蛇床子素的神经保护作用及其对Homer蛋白表达的影响 目的：造成高密度培养神经元氧糖剥夺后，利用OST进行干预，观察其在缺血再灌注神经元损伤中的神经保护作用。方法步骤一：建立高密度大鼠脑皮层神经元体外培养方法；培养7d后，通过免疫组织化学法鉴定培养神经元的纯化率。步骤二：将培养7d的神经元分为空白对照组（Sham组）、单纯氧糖剥夺再灌注损伤组（Con组）、氧糖剥夺再灌注损伤后不同剂量蛇床子素干预组（OST0.01μΜ组、OST0.1μΜ组、OST1μΜ组、OST10μΜ组、OST100μΜ组）；除Sham组外，其余各组均用无糖培养基置换正常培养基，并剥夺氧气供应4小时，换回正常培养条件造成缺血再灌注损伤，然后用蛇床子素对不同剂量OST组进行干预；24h后运用生物化学手段检测各组间Caspase3和Homer1a表达情况。结果：神经元体外培养7d，光镜下见细胞核大而清晰、透亮，圆形或卵圆形，胞体呈多形性，胞质透亮，神经元突起间相互联系，形成网络结构。anti-β-tubulin-Ⅲ和NF200免疫组织化学染色细胞阳性率达95%。氧糖剥夺4h恢复氧糖供应24h后，生化分析结果显示，各OST干预组Caspase3表达均低于Con组而高于Sham组，Homer1a表达则高于Con组。结论：缺血再灌注神经元损伤后，蛇床子素可起到一定程度的保护作用；在对抗该损伤的过程中，Homer1a表达可能发挥一定作用。 实验二：SD大鼠缺血再灌注脑损伤后蛇床子素的神经保护作用及其对Homer蛋白表达的影响 目的：观察在整体动物缺血再灌注脑损伤后OST的神经保护作用。方法步骤一：建立改进的胸廓上口入路大鼠四血管阻塞法（4-vesselocclusion，4VO）脑缺血再灌注模型，其具体操作过程简述如下：将大鼠麻醉，打开胸廓上口，分离双侧锁骨下动脉起始段；用动脉夹夹闭双侧锁骨下动脉起始段和双侧颈总动脉，15min后撤除动脉夹，恢复脑血流再灌注。步骤二：实验用SD大鼠50只随机分为假手术组（Sham组）、单纯缺血再灌注损伤组（Con组）和缺血再灌注损伤后不同剂量OST干预组（OST5mg/kg组、OST25mg/kg组、OST125mg/kg组）；除Sham组动物仅接受手术，不经历动脉夹闭过程外，各组动物均接受4VO处理；恢复再灌注1小时后，各剂量OST干预组动物分别腹腔注射蛇床子素5mg/kg、25mg/kg、125mg/kg。再灌注24h后，各实验组动物进行神经功能学评分，而后，每组随机选取3只动物用于Caspase3和Homer1a蛋白半定量分析，各组剩余的动物用于分析海马CA1区细胞组织形态学变化。结果：改进的模型操作方法简化了原模型制作的操作程序，减小了手术损伤，且缺血效果稳定可靠。各OST组大鼠的行为学评分和组织形态学分析结果均明显优于Con组（P<0.01），并在25mg/kg剂量时表现出最大神经保护效果；各OST组大鼠海马组织Caspase3表达水平显著低于Con组，Homer1a表达均高于Con组。结论：在缺血再灌注脑损伤后蛇床子素有一定的脑保护作用；在该病理生理过程中，Homer1a表达可能发挥一定的保护作用。
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