摘要
背景： 神经病理性疼痛是由神经系统的损害或功能紊乱引起的一种常见而特殊的慢性疼痛，以自发性疼痛、痛觉过敏和触诱发痛为特征。神经病理性疼痛在成年人群的患病率约为5％-25％。神经病理性疼痛不仅给机体带来了极大的痛苦和负担，同时也导致了劳动能力的受限，工作效率的降低。但是，由于神经病理性疼痛病因多样，机制复杂，治疗仍然相当困难。据估计，只有不到半数的患者能得到50％以上程度的疼痛缓解。因此，研究和治疗神经病理性疼痛，对于提高人群生活质量，具有重要意义。 N-甲基-D-天门冬氨酸(NMDA)受体是谷氨酸受体的一个亚型，是一种配体门控型离子通道，在哺乳动物的神经系统具有广泛的分布。NR2B是NMDA受体的其中一个亚基，对NMDA受体药理和功能特性起决定性作用。突触后致密物(PSD)是存在于谷氨酸能突触后膜中的一种特殊结构，其中一种95 kDa的蛋白质——PSD-95，被发现与突触可塑性以及神经病理性疼痛的发生，具有密切的关系。 瞬时感受器电位香草酸受体1（transient receptor potential vanilloid1，TRPV1）属于瞬时感受器电位（transient receptor potential，TRP）超家族的成员，主要表达在初级传入感觉神经元上，是一种非选择性的阳离子通道。TRPV1作为一种与痛觉密切相关的离子通道型受体，在疼痛信号转导中发挥着重要作用。近几年对TRPV1的研究取得了较大进展，在神经病理性疼痛中的作用也越来越受到重视，但是目前为止，仍缺乏相关蛋白质水平的研究。本课题的开展和顺利完成可为神经病理性疼痛的机制和治疗研究提供新的思路和方向。 研究目的： 本研究拟采用药理学手段，RNA干扰技术，形态学和行为学手段，在大鼠坐骨神经慢性压迫性损伤（Chronic Constriction Injury，CCI）模型上，探讨TRPV1在神经病理性疼痛发生发展中的作用及其调制机制，为慢性疼痛的防治提供理论依据。 究方法： 1.雄性Wistar成年大鼠随机分为假手术组（Sham组）和CCI组，测定各组大鼠机械痛阈和热痛阈基础值后，参考Bennett和Xie等的方法建立大鼠左侧CCI模型。 Sham组进行同样的手术，暴露坐骨神经但不结扎。分别于术后1、2、3、4、5、6、7、10、14、21、28天测定各组大鼠的机械痛阈和热痛阈。模型动物在深麻醉下处死，取腰膨大段脊髓背角组织，采用免疫印迹(Westernblot)方法检测TRPV1、NR2B的表达，并用免疫共沉淀（Co-immunoprecipitation， Co-Ip）检测NR2B和PSD-95的相互作用。 2.腰段鞘内置管成功的雄性Wistar成年大鼠随机分为3组:CCI+二甲基亚砜组（CCI+DMSO组）、CCI+Ro25-698130 nmol/10μl组和CCI+Ro100 nmol/10μl组。Ro25-6981为NR2B的选择性拮抗剂。CCI术后第7天开始鞘内注射DMSO或Ro25-6981（溶于100％DMSO），观察NR2B拮抗剂对大鼠机械痛阈和热痛阈的影响。 3.腰段鞘内置管成功的雄性Wistar成年大鼠随机分为4组:Sham组、CCI组、CCI+DMSO组、CCI+Ro25-6981100 nmol/10μl组。CCI术后第7天开始鞘内注射DMSO或Ro25-6981（溶于100％DMSO），取腰膨大段脊髓背角用Westernblot和Co-Ip检测TRPV1的表达以及NR2B和PSD-95的相互作用。 4.腰段鞘内置管成功的雄性Wistar成年大鼠随机分为8组:空白对照组（Navie组）、载体对照(PEI)组、RNA干扰（TRPV1-RNAi）后1天组（1d组）、TRPV1-RNAi3天组（3d组）、5天组（5d组）、7天组（7d组）、14天组(14d组)、21天组（21d组）。CCI术后第7天开始鞘内注射PEI或TRPV1-siRNA（溶于PEI），观察TRPV1-siRNA对脊髓背角TRPV1的沉默效率。 5.腰段鞘内置管成功的雄性Wistar成年大鼠随机分为3组:CCI组、CCI+PEI组、CCI+TRPV1-siRNA5μg/15μl组。CCI术后第7天开始鞘内注射PEI或TRPV1-siRNA（溶于PEI），观察TRPV1 RNA干扰对大鼠机械痛阈和热痛阈的影响。 究结果： 1.术前两组大鼠机械痛阈和热痛阈无显著性差异（P＞0.05），术后第1天，CCI组机械痛阈和热痛阈较Sham组明显下降（P＜0.05），持续至28天以上(P＜0.05)。脊髓腰膨大处TRPV1表达水平测定显示，术后7天CCI组TRPV1的表达较Sham组显著性增加（P＜0.05），NR2B的表达未见显著性变化（P＞0.05）;免疫共沉淀发现，CCI大鼠脊髓背角NR2B和PSD-95的相互作用显著性增加（P＜0.05)。 2.NR2B拮抗剂给药前各组大鼠机械痛阈和热痛阈无显著性差异(P＞0.05)。在CCI术后第7天开始鞘内注射DMSO或Ro25-6981（溶于100％DMSO）。结果显示，与溶媒组比较，Ro25-6981100 nmol/d组能显著性提高大鼠热痛阈(P＜0.05)，但机械痛阈的变化没有统计学意义(P＞0.05)。 3.大鼠CCI后7天，鞘内给予NR2B拮抗剂Ro25-6981100 nmol/d连续3d。Western blot结果显示，鞘内给予Ro25-6981的大鼠，脊髓背角TRPV1蛋白质的表达降低，与DMSO组比较，差异有显著性(P＜0.05)。Co-Ip结果显示，鞘内给予Ro25-6981的大鼠，脊髓背角NR2B和PSD-95的相互作用降低，与DMSO组比较，差异有显著性(P＜0.05)。 4.应用在体RNA干扰技术，对脊髓背角TRPV1进行了基因沉默。Western blot结果显示，在鞘内转染TRPV1-siRNA5μg/d，连续2天，其基因沉默的效率达到50％，作用高峰产生在转染后1天，随后，TRPV1的表达逐渐恢复，至第5天达到对照水平。 5.打药前三组大鼠机械痛阈和热痛阈无显著性差异(P＞0.05)。 CCI后7天，鞘内给予TRPV1-siRNA5μg/d，连续2天，观察了大鼠疼痛阈值的变化。结果显示，大鼠机械缩足反射阈值和热缩足反射潜伏期提高。与对照组比较，差异有显著性(P＜0.05)。 结论： 1.脊髓背角TRPV1的上调介导了大鼠CCI引起的神经病理性疼痛。 2.脊髓背角NR2B通过与PSD-95的相互作用介导了大鼠CCI引起的热痛觉过敏，但不介导机械痛觉过敏。 3.脊髓背角TRPV1的上调需要NR2B的功能正常。
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