摘要
背景： 由于人们物质生活得到极大改善，老年人口逐年增加，导致罹患脑血管病人人数迅速增加，目前脑血管疾病已占我国致残和致死性病因第一位，并且患病人数有逐年增多的趋势，而缺血性卒中占脑血管疾病的80％～85％。缺血性卒中不仅对人类健康造成了巨大的威胁，还给患者家庭和社会带来了严重的负面影响。然而，至今尚无一种对所有缺血性卒中有确切疗效的治疗方法，因此寻找新的治疗缺血性卒中的方法非常必要。 在研究短暂性脑缺血发作过程中，发现了脑组织的缺血预处理;缺血预处理在临床中是一种不切实际的治疗方法;为了消除缺血造成的创伤，有人提出了药物预处理，即通过药物激发或模拟机体内源性物质，如腺苷、缓激肽和一氧化氮(nitricoxide，NO)等而发挥保护作用。 腺苷(adenosine，Ado)及其受体在多种脏器缺血再灌注损伤的保护方面有重要作用。正常情况下脑细胞外液腺苷水平为30～300nmol/L，而在脑缺血等病理状态下，可达到5～40umol/L，最多可达正常时的200多倍。由此可见，急剧增加的腺苷可能是一种内源性的神经保护反应。 星形胶质细胞(astrocyte，AS)主要存在于在中枢神经系统中，对神经元有支持和营养作用。激活后的星形胶质细胞可以释放多种神经递质;当机体遇到组织缺血等病理状态下时，星形胶质细胞释放的物质会明显增加，保护受损神经元并加速病损神经元的功能恢复。大量的体外细胞培养实验也证实了星形胶质细胞条件培养液（astrocyte-conditionedmedium，ACM）中含有多种神经元营养物质，提示ACM的确能够提高损伤神经元的存活率并且加快其功能恢复。虽然星形胶质细胞对神经元的保护作用已被学者们公认，但其作用机制不是很清楚，ACM对受损神经元的营养作用也需进一步探讨。 本课题利用原代细胞培养技术得到星形胶质细胞和神经元，建立模拟脑缺血再灌注损伤模型，用ACM、ACMa及ACM+a干预缺氧损伤的神经元;倒置显微镜下观察星形胶质细胞及神经元形态学变化，流式细胞术检测细胞凋亡结果:XTT法测定其活性，利用免疫荧光技术和免疫细胞化学技术分别测定神经元特异性稀醇化酶（neuron-specificenolase，NSE）强阳性细胞的表达量，各组神经元细胞中caspase-3蛋白表达及活性检测，应用Westernblot分析各组神经元caspase-3的活性。以此来分析星形胶质细胞与腺苷对缺氧/复氧损伤神经元的保护作用，探讨腺苷预处理后的星形胶质细胞培养液的营养性作用，从而进一步揭示腺苷对神经系统的保护机制，为腺苷应用于临床治疗脑血管疾病奠定理论基础。 目的： 分析星形胶质细胞与腺苷(adenosine，Ado)对缺氧/复氧神经元损伤的保护作用，探讨腺苷预处理后的星形胶质细胞条件培养液的营养性作用，从而显示腺苷对神经系统的保护机制，为腺苷应用于临床治疗脑血管疾病奠定理论基础。 材料和方法： 体外培养SD大鼠大脑皮层星形胶质细胞和海马神经元及大脑皮层神经元，纯化后建立模拟脑缺血再灌注损伤模型，收集再灌注18h的星形胶质细胞条件培养液(Astrocyteconditionedmedium，ACM)和经腺苷预处理的再灌注18h的星形胶质细胞条件培养液(ACMa)，然后用ACM、ACMa及ACM+a（ACM+含100μmol/L腺苷的DMEM液）以1∶5的浓度培养缺氧/复氧损伤神经元;倒置显微镜下观察星形胶质细胞及神经元形态学变化，XTT法测定星形胶质细胞及神经元活性，免疫荧光技术和免疫细胞化学技术分别测定胶质纤维酸性蛋白(glialfibrillaryacidicprotein，GFAP)、NSE强阳性细胞的表达量，利用ELISA试剂盒进行星形胶质细胞乳酸脱氢酶（lactatedehydrogenase，LDH）酶联免疫分析，运用流式细胞术检测细胞凋亡，按Promega公司的CaspACETMAssaySystem，Colorimetric试剂盒说明书进行各组神经元caspase-3活性测定，应用Westernblot分析各组神经元caspase-3的活性。 结果： 光镜观察:正常组神经元生长良好，形态规则，胞体椭圆，折光性好，突触连接紧密呈网状;模型组神经元胞体变大不规则，折光性差，突触明显减少或消失;ACMa组、ACM+a组及ACM组细胞状态介于两者之间，总体肉眼观察，其作用:ACMa＞ACM+a＞ACM。 流式细胞术检测细胞凋亡结果:与正常组相比，模型组、ACMa组、ACM+a组和ACM组细胞凋亡均显著增加;而ACMa组、ACM+a组和ACM组细胞凋亡显著低于模型组，ACMa组细胞凋亡显著低于ACM+a组和ACM组，ACM+a组和ACM组细胞凋亡无明显差异。 XTT法细胞活性检测:模型组神经元活力下降，OD值明显低于正常对照组。ACMa组、ACM+a组及ACM组细胞活力均高于模型组，根据OD值，其作用:ACMa＞ACM+a＞ACM。 NSE的测定:ACMa组、ACM+a组及ACM组神经元表达NSE的能力均较模型组提高，对染色结果阳性的细胞培养片进行图像分析，其作用:ACMa＞ACM+a＞ACM。 caspase-3的活性:ACMa组、ACM+a组及ACM组神经元caspase-3的活性均较模型组下降，其作用:ACMa＞ACM+a＞ACM。 caspase-3活性测定结果显示:与模型组相比，ACMa组、ACM+a组和ACM组神经元细胞中Caspase-3活性均显著降低;而ACMa组Caspase-3活性低于ACM+a组和ACM组，ACM+a组和ACM组细胞凋亡无明显差异。 结论： 1、通过细胞活性检测及受损神经元NSE的表达量反映出ACM对缺氧/复氧损伤的神经元有保护和修复作用; 2、通过对神经元凋亡的检测，以及受损神经元caspase-3的活性变化表明ACM具有抑制凋亡作用; 3、星形胶质细胞在脑缺血再灌注损伤中起着重要作用，腺苷预处理可增强星形胶质细胞对受损神经元的保护和修复。
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