摘要
背景:皮肤癌是人类最常见的肿瘤之一,皮肤鳞状细胞癌(SCC)约占全部皮肤癌的20%。常规采用手术、激光、冷冻、放疗等直接去除或破坏肿瘤组织,存在组织结构破坏性大、易复发、复发后再次治疗困难等诸多限制。5-氨基酮戊酸光动力治疗(ALA PDT)是一种全新的治疗技术,通过光源、氧气和5-氨基酮戊酸(ALA)的相互作用来破坏肿瘤细胞和肿瘤组织。ALA在肿瘤细胞内转换成内源性光敏性物质原卟啉IX(PpIX),在特定波长的照射下,PpIX使氧气转换成有活性的单态氧,单态氧氧化损伤细胞器和生物分子,导致肿瘤死亡。ALA PDT的优势在于创伤性小,治疗后不影响美观、不破坏特殊部位的结构和功能,病人耐受性好,可在同一部位重复多次治疗。但是ALA PDT的缺点是治疗深度有限,在治疗深在性侵袭性皮肤SCC时疗效还不甚理想。这主要是因为给药后ALA在深部SCC组织中的浓度低、分布不均,光动力反应的效率有限。基于ALA PDT治疗机制和存在不足,设想开展以下两方面研究,以提高ALA PDT治疗皮肤SCC的疗效:1.提高肿瘤细胞吸收ALA转换成原卟啉IX的能力,增强光动力反应效率;2.提高ALA在组织中的渗透深度、分布的均匀性,对肿瘤的靶向选择性。因此,本研究设想通过纳米粒药物运输系统(NDDS)来提高肿瘤细胞吸收ALA转换成原卟啉IX的能力,增强光动力反应效率从而提高疗效。NDDS指的是利用纳米粒包裹运输药物。从纳米粒的安全性出发,本研究选择聚乳酸羟基乙酸纳米粒(PLGA NPs)包裹运输光敏剂ALA。希望制备出5氨基酮戊酸聚乳酸羟基乙酸纳米粒(ALA PLGA NPs),通过增强光敏剂ALA的稳定性、提高SCC细胞吸收ALA的效率、提高原卟啉IX的生成量,从而提高ALA的光动力反应效率。此外,纳米粒还有EPR效应(enhanced permeability and retention effect,EPR effect),能提高ALA对皮肤SCC组织的靶向选择性。所以,设想通过ALA PLGA NPs的应用来提高ALA PDT治疗皮肤SCC的疗效。 目的:通过PLGA NPs装载ALA,增强PDT对人皮肤鳞癌A431细胞的体外抑制作用。包括⑴建立ALA的微量测定方法。⑵制备ALA PLGA NPs并对其进行表征。⑶评价ALA PLGA NPs PDT对人皮肤鳞癌A431细胞的体外抑制作用。 方法:⑴ALA的检测:采用荧光胺柱前衍生化HPLC-荧光法对ALA进行检测,以荧光胺作为荧光衍生化试剂,使用C18柱,以乙腈-0.1%三氟乙酸溶液(30︰70)为流动相,激发波长和发射波长为398nm和480nm。⑵ALA PLGA NPs的制备和表征:采用超声-复乳法制备ALA PLGA NPs。超声功率:120w;超声时间:初乳40s,复乳40s;ALA浓度(w/v):2.02%,内水相(PBS(pH5))体积:0.52ml;PLGA浓度(w/v):7.5%,并以30%甘露醇为支架剂进行冷冻干燥。采用激光粒度分析仪测定纳米粒粒径,荧光胺衍生化HPLC-荧光法检测ALA PLGA NPs的包封率、载药量、缓释。扫描电镜观察ALA PLGA NPs形态,红外光谱仪测定结构,差示扫描量热仪测定物相。⑶ALA PLGA NPs PDT抑制鳞癌A431细胞体外增殖:鳞癌A431细胞与含有2.7mg/ml ALA PLGA NPs(相当于0.1mM ALA)无血清培养基、以及含有0.1mM ALA无血清培养基分别避光孵育4h后采用透射电镜进行细胞形态学研究。接着,鳞癌A431细胞分别与含有2.7mg/ml ALA PLGA NPs、2.7mg/ml PLGA NPs以及0mM(空白对照),0.1mM,1mM,5mM,10mM ALA的无血清培养基避光条件下共孵育,于孵育1h,2h,3h,4h,5h,6h,8h,12h,14h,16h,18h,20h,22h,24h后,测定生成的原卟啉IX荧光强度。最后,采用MTT法检测ALA PLGA NPs PDT对A431细胞体外增殖的抑制作用。实验分为2.7mg/ml ALA PLGA NPs PDT组,0.1mM ALA PDT组,1 mM ALA PDT组,2.7 mg/ml ALA PLGA NPs避光组,0.1mM ALA避光组,1mM ALA避光组,单纯红光组,以及阴性对照组。孵药24h后,采用635nm He-Ne激光器(波长635nm,8J/cm2,8.6mW/cm2)照射,再24h后MTT法观察结果。 结果:⑴以荧光胺衍生化HPLC-荧光法测定ALA,ALA在0.0475~47.5 g/ml浓度范围内线性关系良好。回收率为99.2%,RSD为1.46%。⑵采用超声-复乳法制得的ALA PLGA NPs冻干粉平均粒径为65.6±26nm,包封率为65.8±7.2%,载药量为0.62±0.27%,6h左右释药量为80%,纳米粒大小均匀,表面光滑。ALA在PLGA NPs中结构无变化,但形成了新的物相。⑶ALA PLGA NPs与鳞癌A431细胞共孵育后,大量ALA PLGA NPs被鳞癌细胞吸收,且主要集中于细胞质中。ALA PLGA NPs或ALA与鳞癌A431细胞敷育1-24h,产生的原卟啉IX荧光强度随时间递增。孵育6h时,2.7mg/ml ALA PLGA NPs(相当于0.1mM ALA)生成的原卟啉IX荧光强度高于各浓度的游离ALA,与0.1mM ALA相比有统计学差异(P<0.01),但与1mM ALA相比无统计学差异(P>0.01)。孵育24h时,2.7mg/ml ALA PLGA NPs产生的原卟啉IX荧光强度大于0.1mM ALA(P<0.01),小于1mM ALA(P<0.01)。体外增殖实验结果显示0.1mM ALA、1mM ALA与2.7mg/ml ALA PLGA NPs对鳞癌A431细胞无明显的暗毒性,单纯红光对A431细胞也无明显的杀伤作用。孵育6h时2.7mg/ml ALA PLGA NPs PDT对A431细胞的杀伤作用明显高于0.1mM ALA(P<0.01),与1mM ALA PDT相当(P>0.01)。孵育24h,2.7mg/ml ALA PLGA NPs PDT对A431细胞的杀伤作用也明显强于0.1mM ALA PDT(P=0.006,P<0.01),但小于1mM ALA PDT。 结论:⑴荧光胺柱前衍生化HPLC-荧光法操作简单,能准确地对微量ALA进行测定;⑵采用优化后的超声-复乳法制备出的ALA PLGA NPs粒径、形态理想,包封率、载药量可,再分散性好;⑶PLGA NPs装载ALA能有效地增强ALA PDT对人皮肤鳞癌A431细胞的体外抑制作用。
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