摘要
第一部分：CNP及其受体NPR-B在人精子上的表达定位 目的：检测CNP及其特异性受体NPR-B在人精子上的免疫定位,初步探讨其与精子功能的相关性。 方法：利用间接免疫荧光技术,激光共聚焦下观察CNP及NPR-B在人精子上的表达定位。 结果：NPR-B主要表达于人精子头部的顶体区及尾部前段胞膜上,CNP则未见表达。 结论：CNP的受体NPR-B特异表达于人精子头部的顶体区及尾部前段胞膜上,提示CNP可能对精子运动能力、顶体反应及受精能力有一定的影响。 第二部分：CNP对人精子活力、活率、顶体反应的影响 目的：观察CNP对体外培养的人精子活力、活率及顶体反应的影响 方法：从湖北省人类精子库收集初筛常规分析正常的精液标本,将精子分离体外培养,每一份标本根据精子体外培养液中CNP的浓度不同分为三组,阴性对照组,CNP10-7mol/L组,CNP10-6mol/L组,在加入CNP后5min、30min、60min、120min、240min分别检测各组精子的活力、活率,每次检测需重复计数3次取均值,活率计数用伊红Y染色法。分别于加入CNP后0h、3h、6h用考马斯亮蓝R250染色法观察CNP对精子顶体反应的影响,每次检测需重复计数3次取均值。 结果：1、在相同时间点将CNP处理组和对照组的精子活力、活率进行比较,发现处理组精子活力、活率在30min时比对照组的精子活力、活率高,并且呈现剂量依赖性,CNP10-6mol/L组的刺激作用更加显著,经方差分析,与对照组相比,CNP10-7mol/L组的差异有显著性意义(P<0.05),CNP10-6mol/L组的差异有明显统计学意义(P<0.01),其它时间点无明显差异。2、不同浓度CNP与精子共培养6h后,与对照组相比精子顶体反应率明显升高,并且也呈剂量依赖性,CNP10-6mol/L组的作用更加显著,经方差分析,其中CNP10-7mol/L组与对照组比较差异有显著性意义(P<0.05),而CNP10-6mol/L与对照组比较差异更具显著意义(P<0.01)。 结论：CNP能够增强体外培养精子的活力、活率,增加体外培养精子自发顶体反应,这些很可能在精子获能、受精中起着重要作用。 第三部分：CNP对小鼠体外受精及早期胚胎发育的影响 目的：观察CNP对小鼠体外受精和早期胚胎发育的影响,初步探讨CNP对小鼠体外受精率的影响及小鼠早期胚胎发育的作用,并探究其剂量效应关系。 方法：根据体外受精及胚胎培养液中CNP的浓度不同将实验设为三个组别:阴性对照组;CNP10-7mol/L组;CNP10-6mol/L组。取昆明雌鼠18只及雄鼠6只,对雌鼠行促排卵及促卵成熟,收集成熟卵母细胞随机平均放入体外受精培养液中,对雄性小鼠附睾尾取精,加入培养液中,使其受精,放入37℃,5%CO2培养箱中培养。培养4-6h将卵母细胞取出,置入新培养液中培养。观察指标:体外受精24h观察2-细胞形成情况,以2-细胞的形成率代表其受精率,此后根据小鼠体内受精卵的发育与运行规律,96h后统计囊胚形成率。 结果：阴性对照组2-细胞形成率为62.7%;CNP10-7mol/L组为66%;CNP10-6mol/L组为73.8%,CNP处理组均高于对照组,但经χ2检验仅CNP10-6mol/L组与对照组的差异具有统计学意义(P<0.05);阴性对照组囊胚形成率为30.4%,CNP10-7mol/L组为45.7%;CNP10-6mol/L组为35.5%,CNP10-6mol/L组的囊胚形成率略高于对照组,经χ2检验差异没有统计学意义,而CNP10-7mol/L组则显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.01)。 结论：CNP能够提高小鼠体外受精率,并且增加小鼠体外受精囊胚形成率。其可能原因是:首先CNP可能通过增强体外培养精子的活力、活率及增加精子顶体反应,从而使受精率增加;其次CNP在10-7mol/L的浓度下能明显增加小鼠体外受精囊胚形成率,提示CNP可能是早期胚胎发育的一个重要因子,而10-7mol/L则是早期胚胎发育的一个敏感浓度。
NETL