摘要
已有研究表明无脊椎动物中存在一定程度特异性的获得性免疫，称之为免疫致敏，但目前对其潜在机制的了解还非常有限。本研究采取分子、细胞生物学等手段，研究了长牡蛎免疫致敏现象的分子和细胞特征，探讨吞噬相关分子和信号通路及其与免疫致敏的关系，查明了长牡蛎血淋巴细胞和血清在免疫致敏过程中的作用。 经灭活的灿烂弧菌初次刺激的牡蛎在遭受活的灿烂弧菌二次刺激时，其在细胞水平呈现出更强的免疫响应。灭活的灿烂弧菌初次刺激后，牡蛎总血淋巴细胞数量(THC)显著增加，新生的循环血淋巴细胞数量仅在24小时出现略微增加，血淋巴细胞的吞噬率在12小时上升至最高值。活的灿烂弧菌再次刺激后，牡蛎THC的增加幅度更加明显，同时更快地达到峰值（6小时），新生的循环血淋巴细胞数量在6小时显著增加，其增殖率较初次刺激时升高近4倍，血淋巴细胞的吞噬率在12小时显著增强并高于第一次刺激。同时，再次刺激后增强的血淋巴细胞吞噬作用对灿烂弧菌是高度特异的，能有效地区别鳗弧菌、溶珊瑚菌、耶罗维亚酵母和藤黄微球菌。 在连续两次灿烂弧菌刺激后，长牡蛎造血相关基因CgRunx1和CgBMP7的最高表达量显著高于第一次灿烂弧菌刺激，而CgGATA3的表达水平未检测到显著变化，牡蛎血淋巴细胞中吞噬受体CgIntegrin及其下游信号通路关键分子CgPI3K、CgRho J、CgMAPKK、CgRab32、CgNADPH oxidase的表达量显著升高，CgEcSOD的表达水平显著低于初次刺激，而CgPKC、CgMyosin、CgActin、CgToll6的表达均未检测到显著变化。CgIntegrin定位于长牡蛎血淋巴细胞膜上，抗体封闭实验证实其主要介导血淋巴细胞对灿烂弧菌的吞噬作用。CgToll6定位在细胞膜及胞浆中，对LPS和PGN有较强的结合活性，而对Mannan的结合极其微弱，其对灿烂弧菌、鳗弧菌、金黄色葡萄球菌和藤黄微球菌及毕赤酵母均具有强结合活性，而对耶罗维亚酵母结合能力较弱。牡蛎血清中CgEcSOD蛋白对LPS、PGN和Ploy I∶C具有较强的结合活性，并表现出一定的血清剂量依赖效应，但不结合Mannan。CgEcSOD对灿烂弧菌、鳗弧菌、金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、毕赤酵母以及耶罗维亚酵母菌具有Cu2+剂量依赖的结合活性。 转入致敏血清（灭活的灿烂弧菌刺激4天后的牡蛎血清）的牡蛎在灿烂弧菌刺激后，血淋巴细胞增殖率在6小时显著升高，凋亡率在6-24小时显著下降，而THC在6和48小时显著减少，吞噬率在后期（24和48小时）显著增加。转入致敏血淋巴细胞（灭活的灿烂弧菌刺激4天后的牡蛎血淋巴细胞）的牡蛎接受灿烂弧菌刺激后，血淋巴细胞增殖率在6小时显著升高，凋亡率在24小时显著下降后在48小时又显著上升，THC在24小时显著增加而在48小时显著减少，吞噬率先在12小时显著下降，后在48小时显著升高。而共转入致敏血淋巴细胞和血清（灭活的灿烂弧菌刺激4天后的供体牡蛎血淋巴）的牡蛎在响应灿烂弧菌刺激后，其血淋巴细胞凋亡率在6和24小时显著下降，然而增殖率和THC在6小时极显著下降，THC和吞噬率在12小时显著增加。 本研究表明，灿烂弧菌连续刺激能引发长牡蛎的免疫致敏现象，牡蛎能通过加速血淋巴细胞增殖并提高其吞噬能力来应对病原菌的再次侵染。牡蛎血淋巴细胞受体CgIntegrin介导的信号转导通路参与免疫致敏中特异性增强的吞噬作用，血清高丰度蛋白CgEcSOD可能通过降低炎性反应的能耗介导长牡蛎免疫致敏。少量的血淋巴细胞可能在长牡蛎免疫致敏中发挥关键作用。该研究结果进一步深化了对无脊椎动物免疫致敏现象的认识，为揭示免疫致敏的细胞和分子机制奠定了基础。
NETL