摘要
昆虫与细菌、酵母等微生物的共生对很多重大害虫的危害起着重要的推动作用，功能包括消化纤维素、固氮、转化信息素、降解有害物质、影响蓝变菌生长等等。红脂大小蠹Dendroctonus valens（Red Turpentine Beetle，RTB）是起源于北美的入侵种，由于在中国已致死上千万棵油松和其它松树，而成为最具破坏力的林业害虫之一。研究发现，它在中国的成功定殖和爆发，与协同入侵的一种蓝变菌Leptographium procerum对其聚集进攻的帮助有着紧密的联系。但当RTB成功攻克寄主抗性之后，蓝变菌在坑道中的生长对定殖期幼虫的生长发育产生了不利的影响，并且发现这种不利是通过与幼虫竞争韧皮的糖分资源引起的。已报道细菌、放线菌和酵母都能够影响蓝变菌的生长，在塑造微生物群落结构中具有重要的作用。RTB是否可以利用这些微生物来协助应对蓝变菌在不同阶段利害角色的改变，是本文要解决的主要科学问题。研究内容首先在于调查清楚中国RTB伴生细菌及酵母在不同阶段和微生境的群落组成（分离培养和变性梯度凝胶电泳DGGE），探讨其可能存在的生态功能，并进行中美间的差异比较，最后侧重研究伴生细菌（含放线菌）及酵母对蓝变菌的影响。主要结论如下。 分离方法共鉴定细菌约59种、酵母21种。其中肠道分离有23种细菌、11种酵母，体表有40种细菌、20种酵母，蛀屑有25种细菌、11种酵母。细菌分别隶属于4门5纲11科26属，4门为变形菌门、硬壁菌门、放线菌门和拟杆菌门，主要属为Pseudomonas、Rahnella、Serratia、Erwinia、Bacillus和Streptomyces（链霉菌）;酵母主要隶属于子囊菌门，主要种为Candida piceae(Ogataea clade)、Cyberlindnera americana、Candida oregonensis(Metschnikowia clade)、Candidanitratophila(Ogataea clade)和未描述种Saccharomycopsis sp.。DGGE方法检测到58个细菌OTUs，含未分离到的α-变形菌纲、酸杆菌门、Gemmatimonadetes和Planctomycetes种类;22个酵母OTUs，含未分离到的种7个。 中美RTB伴生细菌和酵母既存在很大共性，也有一定的差异。共有的细菌有8种，酵母有9种，均涵盖了大部分优势种，这暗示它们与RTB可能具有十分紧密的共生关系。差异最大的属是Pseudomonas和Streptomyces。中国RTB伴生的Pseudomonas不仅量很大，而且种类非常之多达11种，其中最优势种Pseudomonas sp.11在北美RTB可能并不存在，即使也存在，推测丰度应该较小。中国RTB伴生的Streptomyces种类多达16种，这在北美RTB仅见报道有6种。这两个属均主要存在于蛀屑之中，且均因抗菌能力强而成为下一步研究的重点。Rahnella是成虫和幼虫间差异较大的属，在幼虫肠道中所占比例高达62.7％，而成虫肠道中Rahnella和Pseudomonas各占25.3％和31.2％。而此属唯一的Rahnelta aquatilis据报道有很强的固氮能力，因此推测它对幼虫的生长发育有很大贡献。酵母优势种中仅Ca.nitratophila只在中国RTB分离到，且幼虫伴生的Ca.nitratophila相对成虫更多，这个种因固氮能力强而如此命名，故可能对RTB在中国的成功定殖有一定贡献。 RTB伴生细菌和酵母的数量，无论是在肠道还是在体表，基本呈现从扬飞期成虫，到定殖期幼虫和定殖期成虫对数增长的动态变化;定殖期幼虫蛀屑和成虫蛀屑中的细菌比早期进攻期蛀屑中的数量多达上万倍。各个微生境中细菌的数量总体比酵母多，尤其是定殖期成虫肠道细菌比酵母多达上千倍。根据不同阶段伴生细菌和酵母的数量，在后续生测试验中选择了两种梯度对其进行模拟。 通过室内人工培养基上的生测实验，大部分细菌的挥发物在低浓度时（模拟进攻期细菌的量）对RTB幼虫坑道的蓝变菌Lep.procerum和Ophiostoma minus生长的影响并不明显，但在高浓度时（模拟定殖期细菌的量）大多对二者产生了很强的抑制作用;Streptomyces整体则表现了较强的接触性抑制作用;无论是挥发性抑制还是接触性抑制，多数对有害菌Op.minus的抑制作用更强，而对进攻期有益但幼虫期有害的Lep.procerum的抑制作用较弱;酵母则未表现出明显的抑制效果。通过在韧皮粉培养基上接种蓝变菌发现，高浓度细菌挥发物对两种蓝变菌的生长仍具有抑制作用，虽不如之前强烈，但Pseudomonas sp.11（中国RTB蛀屑最优势种）对Op.minus的抑制作用仍然很强。通过检测蓝变菌消耗韧皮粉培养基中的糖分发现，Lep.procerum在细菌挥发物存在下从优先消耗果糖和葡萄糖转变为优先消耗果糖和油松中另一种碳水化合物松醇，而保留了韧皮粉中很多的葡萄糖，从而从营养上对RTB幼虫的生长发育提供了保护。如此，不仅验证了RTB伴生细菌可以抑制幼虫坑道蓝变菌生长的假说，还发现了一种新的共生机制，即细菌能够通过挥发物改变Lep.procerum的糖代谢途径，使其不优先消耗葡萄糖，从而减少了对幼虫的不利影响，形成细菌-蓝变菌-RTB三者营养上的协同和适应。 综合以上，本文通过对RTB伴生细菌和酵母群落进行本底调查、功能分析、中美比较，抑制蓝变菌生长假说的验证，以及新的共生机制的提出，丰富了对RTB伴生微生物群落的理解，以期有助于将来林业有害生物的综合防治。
NETL