摘要
大豆疫霉根腐病又称大豆疫霉根茎腐病、枯萎病，病害由大豆疫霉菌（Phytophthora sojaeKaufmann& Gerdemann）引起。 Harpins可以诱导植物的过敏性反应(hypersensitive reaction，HR)，HIN1(harpin-induced1)是Harpin诱导表达的蛋白之一，HIN1在植物中可诱导抗病，但是目前还未见大豆HIN1的报道。本研究首次在课题组以高抗大豆品种“绥农10”为试材构建的受疫霉菌诱导后差异表达的eDNA消减文库的基础上，选取了文库中一条经本地Blast比对后发现与拟南芥AtNHL3(GeneAccession no.BT000871.1)具有较高同源性的高上调表达的EST序列;本研究用RT-PCR技术从“绥农10”中分离出基因全长序列，是大豆中的新基因，命名为GmHin1。通过生物信息学工具对DNA序列及其编码的蛋白序列进行分析;利用实时荧光定量PCR分析表达情况，具体研究结果如下: 1.GmHin1基因的eDNA全序列为871bp，开放阅读框(ORF)为651bp，编码216个氨基酸，并且含有HIN1保守结构域LEA-2。它为疏水性蛋白质，理论等电点(pI)为9.63，估计分子量为24.48KDa。同源序列比较发现，大豆Hin1基因编码氨基酸序列与烟草NtHIN1(CAA68848)、烟草NtHIN2(BAC15623)、马铃薯StHIN1(AAN52931)编码的推测蛋白氨基酸序列同源性较高，由高到低依次为烟草NtHIN1(57％)＞烟草NtHIN2(56％)＞马铃薯StHIN1(55％)。 2.Real time-PCR表明，Hin1基因在大豆根、茎、叶中均表达，在根和叶片中表达较强，在茎中表达微弱;Hin1基因的表达受疫霉菌、外源激素茉莉酸(JA)、水杨酸(SA)、赤霉素(GA3)和脱落酸(ABA)诱导。GmHin1在非生物因素胁迫下为上调表达，对机械损伤处理应答最为敏感，其次为干旱处理，最后为低温胁迫。 3.构建了GFP融合表达载体pCAMBIA1302-Hin1，利用基因枪法轰击洋葱表皮细胞，结果表明Hin1基因表达蛋白主要分布在细胞膜中。 4.构建了pCAMBIA3301-Hin1植物过量表达载体，利用农杆菌介导法转化烟草叶盘，经PCR扩增检测，获得阳性植株19株T0代植株。对转基因烟草阳性植株接种烟草疫霉，结果表明与非转基因烟草相比抗性增强。
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