摘要
目的: 胰岛素抵抗是2型糖尿病主要的病理机制之一。本论文以荔枝核提取物为研究对象，围绕胰岛素抵抗，采用高脂饮食加链脲佐菌素诱导2型糖尿病大鼠动物模型、3T3-L1脂肪细胞模型，运用药理学和细胞生物学的研究方法，探讨荔枝核提取物（即荔枝核有效部位群，含总皂苷、黄酮和鞣质）改善胰岛素抵抗的作用及机制。 方法: 实验一:荔枝核提取物改善高脂饮食加链脲佐菌素诱导2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗作用及机制研究 1.高脂饲料饲养SD大鼠8周，然后腹腔注射小剂量链脲佐菌素(STZ，30mg/kg)，在两者共同作用下建立理想的胰岛素抵抗(IR)2型糖尿病大鼠模型。 2.观察荔枝核提取物对2型糖尿病大鼠空腹血糖的影响。 3.糖尿病大鼠连续给药4周后，用口服糖耐量实验(OGTT)法，观察荔枝核提取物对糖尿病大鼠糖耐量损伤的影响。 4.连续给药4周后，检测荔枝核提取物高、低剂量组治疗后对糖尿病大鼠FINS、ISI、HOMA-IR、HBCI、TG、HDL-C、LDL-C、ALT和TP等水平的改变，观察药物对胰腺组织GRP78 mRNA和CHOP mRNA表达的影响。 实验二:荔枝核提取物改善3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗作用及机制研究 1.采用3T3-L1前脂肪细胞在完全培养基(高糖DMEM培养基中添加体积分数10％FBS)于37℃、体积分数5％CO2条件下培养，取对数生长的细胞，以5×104/mL的密度接种于96孔培养板中，细胞完全融合后，接触抑制48h后，加入分化诱导剂Ⅰ(0.5mmol/L IBMX、1umol/L DE、10mg/L insulin)，作用48h后，再采用分化诱导剂Ⅱ（10mg/L insulin），将3T3-L1前脂肪细胞诱导分化成成熟的脂肪细胞（分化成熟的脂肪细胞采用油红O染色的方法进行鉴定）。 2.将分化成熟的脂肪细胞分为5组，即空白对照组、荔枝核提取物高剂量组(0.4mg/mL)、荔枝核提取物低剂量组(0.2mg/mL)、罗格列酮(1×10-5mol/L)组及IR模型组，每组7个复孔。除细胞对照组外，其余各组细胞均以地塞米松(1×10-6 mol/L)诱导细胞IR，48h后各给药组加入受试药物，细胞对照组与模型组改为普通培养液，药物作用48h后，取上清液，用葡萄糖氧化酶法测定上清液中的葡萄糖含量。 3.药物作用细胞48h后，以空白对照组和罗格列酮组分别作为阴性和阳性对照组，采用Real-time PCR检测各组细胞RETN mRNA、PTP1B mRNA和GRP78 mRNA表达水平。 结果: 实验一:荔枝核提取物改善高脂饮食加链脲佐菌素诱导2型糖尿病大鼠胰岛素抵抗作用及机制研究 1.高脂饲料加小剂量腹腔注射STZ联合诱导，成功建立胰岛素抵抗动物模型。 2.荔枝核提取物高剂量组(1.87g/kg)及低剂量组(0.47g/kg)可在一定程度上降低糖尿病大鼠空腹血糖;高剂量组与模型组比较，差异具有显著性意义(P＜0.01)。 3.荔枝核提取物高、低剂量组能降低糖尿病大鼠口服糖耐量各个时间点的血糖值，高剂量组与模型组比较，差异具有显著性意义(P＜0.05)，提示荔枝核提取物对糖尿病大鼠糖耐量的损伤有修复作用。 4.荔枝核提取物高、低剂量组能够显著提高糖尿病大鼠胰岛素敏感指数ISI，与模型组比较有显著性差异（P＜0.05）;并可明显降低稳态胰岛素抵抗指数HOMA-IR，与模型组比较有显著性差异(P＜0.01)。提示荔枝核提取物通过增加胰岛素敏感性和提高胰岛β细胞功能而改善2型糖尿病大鼠的胰岛素抵抗。 5.荔枝核提取物高剂量组可显著降低2型糖尿病大鼠血清TG水平，与模型组比较差异有显著性差异(P＜0.05)，提示荔枝核提取物有调节脂代谢的作用。 6.荔枝核提取物高、低剂量组能够显著降低糖尿病大鼠血清中ALT水平，并提高TP水平，与模型组比较，差异均有显著性意义(P＜0.05)，提示荔枝核提取物能改善糖尿病大鼠的肝功能。 7.荔枝核提取物高、低剂量组可以改善大鼠胰腺组织，尤其是胰岛的病理损伤，并促进内质网、线粒体等损伤细胞器的修复。 8.荔枝核提取物高、低剂量组能够显著降低糖尿病大鼠胰腺组织GRP78 mRNA表达水平，与模型组比较，差异具有著性意义(P＜0.001);高剂量组能显著降低CHOP mRNA表达水平，与模型组比较，差异有显著性意义(P＜0.05)，提示荔枝核提取物改善胰岛素抵抗机制可能与抑制GRP78、CHOP基因的mRNA表达有关。 实验二:荔枝核提取物改善3T3-L1脂肪细胞胰岛素抵抗作用及机制研究 1.3T3-L1前脂肪细胞的培养、诱导分化和鉴定实验:3T3-L1前脂肪细胞在诱导分化为3T3-L1脂肪细胞的过程中，胞浆中脂肪滴从无到有，由小变大，细胞形态逐渐变圆，在诱导分化至9-10天左右，采用油红O染色观察。 2.MTT检测结果:确定荔枝核提取物在浓度为0.4mg/mL和0.2mg/mL时，作用于脂肪细胞48h，对其增值无显著影响。 3.荔枝核提取物对3T3-L1脂肪细胞葡萄糖消耗的影响:实验的结果显示，地塞米松有明显抑制3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖摄取的作用;荔枝核提取物高剂量组能显著改善胰岛素抵抗，促进3T3-L1脂肪细胞对葡萄糖的吸收，与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)。 4.荔枝核提取物对3T3-L1脂肪细胞RETN mRNA、PTP1B mRNA及GRP78 mRNA表达水平的影响:Real-time PCR结果显示，荔枝核提取物高、低剂量组的RETNmRNA、GRP78 mRNA表达均显著下降，与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.01); PTP1B mRNA表达以高剂量组的下降明显，与模型组比较，差异有显著性差异(P＜0.05)。 结论: 1.荔枝核提取物明显降低高脂饮食加链脲佐菌素诱导胰岛素抵抗2型糖尿病大鼠空腹血糖水平，提高2型糖尿病大鼠的胰岛素敏感指数(ISI)，降低稳态胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)，提示荔枝核提取物具有改善胰岛素β细胞功能的作用，这与改善大鼠胰组织病理损伤结果相一致，其改善胰岛素抵抗的作用机制与抑制胰组织内质网应激关键蛋白GRP78及CHOP的mRNA基因表达，从而改善胰岛的内质网应激损伤有关。 2.荔枝核提取物可明显提高胰岛素抵抗3T3-L1成熟脂肪细胞葡萄糖的消耗量，其作用机制与抑制RETN mRNA、GRP78 mRNA和PTP1B mRNA的表达、从而改善胰岛素信号传导有关。
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