摘要
洋桔梗(Eustoma grandiflorum Griseb.)，又名草原龙胆，是龙胆科(Gentianaceae)草原龙胆属的一、二年生草本观赏植物。洋桔梗植株轻盈潇洒，花色典雅明快，花形别致可爱，具有较高的经济价值和观赏价值，是目前国际上十分流行的切花种类之一。 然而，自从洋桔梗在全世界范围内大面积引种栽培以来，很多国家和地区在洋桔梗栽培过程中都相继发现了不同类型的病害，其中由真菌引起的病害占其总病害的80％以上。因此，培育出抗真菌的洋桔梗新品种十分重要。本研究以洋桔梗‘Double Mariachi Pink’品种为试验材料，通过农杆菌介导的叶盘转化法，将烟草β-1，3-葡聚糖酶基因转入洋桔梗中，以期获得抗真菌的转基因洋桔梗植株。 首先，将保存在-80℃冰箱中含有重组质粒pBI121-Glu（携带烟草β-1，3-葡聚糖酶基因的载体）的大肠杆菌活化并鉴定。接着，提取重组质粒，并通过电转化法将重组质粒转入农杆菌LBA4404中，经菌落PCR鉴定获得含有重组质粒的农杆菌。然后，制备农杆菌侵染液，并侵染洋桔梗叶盘。 其次，在卡那霉素选择压的筛选条件下，对叶盘分化出的再生芽进行筛选增殖，共获得35个抗性无根苗系。接着，将抗性苗转接到生根筛选培养基(1/2MS+NAA0.1 mg/L+Km15mg/L)中进行生根筛选，获得21个生根的抗性植株系。继而，分别根据外源目的基因、选择标记基因和T-DNA旁侧序列设计三对引物，对生根的抗性植株进行三次PCR检测，共获得5个阳性转化株系。最后，利用RT-PCR技术检测5个PCR检测呈阳性的转化株系，确定其中3个转基因洋桔梗株系能够正常进行转录。 最后，分别对3个转基因洋桔梗株系（EG6、EG11和EG17）进行了β-1，3-葡聚糖酶活性测定、离体叶片抗灰霉病鉴定以及出瓶活体抗灰霉病鉴定。酶活测定结果表明，转基因株系EG6和EG17的β-1.3-葡聚糖酶活性（分别为0.301U和0.401U）与未转化株系酶活(0.236U)有显著性差异，而EG11的酶活(0.243U)与对照没有显著性差异。在离体叶片对灰霉病的抗性试验中，转基因株系EG17的感病叶片的病斑面积（约0.43cm2）最小，与对照叶片的病斑面积（约2.2cm2）存在显著性差异。在出瓶活体抗灰霉病鉴定中，转基因株系和对照株系的叶片感病率均高于70％，没有显著性差异，这可能是外源基因在洋桔梗植物基因组的拷贝数少、表达水平低等原因造成的。在今后的研究中，侧重于提高外源基因在洋桔梗植株中的表达，以及与几丁质酶基因共同导入植株，以提高转基因洋桔梗植株的抗真菌能力。
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