摘要
红螯光壳螯虾（Cherax quadricarinatus）原产于澳大利亚，是我国近几年来一种新兴的养殖品种。个体大，生长快，当年苗种人工养殖4-6个月即可达到60～180g，同时肉质鲜美、出肉率高，因此具有广泛的养殖前景。世界范围内红螯光壳螯虾相对落后、不完善的研究现状，严重制约了整个产业的发展。而关于养殖水体水质因子对红螯光壳螯虾影响的研究领域，现今几乎一片空白，亟待补充。本研究拟通过研究水体中最常见的两者污染物氨氮及亚硝酸氮，对红螯光壳螯虾的生态及细胞毒性效应以及一些环境因子对其毒性的影响，为养殖期间的水质管理、养殖生产稳定健康发展提供理论依据，最大程度避免水体氨氮和亚硝酸氮污染对养殖效益造成损失;并为研究氨氮及亚硝酸氮在对甲壳动物的毒性机制提供新的角度。 1.氨氮和亚硝酸氮对红螯光壳螯虾幼虾的急性致死效应 红螯光壳螯虾幼体在氨氮暴露24h、48h、72h、96h后，其总氨氮的LC50分别为51.02(44.58-58.43)、24.99(19.17-32.89)、17.83(13.50-37.22)和15.38(8.50-27.94) mg L-1，而非离子氨的LC50值为1.19(1.04-1.37)、0.58(0.45-0.77)、0.42(0.32-0.87)和0.36(0.20-0.65) mg L-1。随暴露时间的延长，LC50值不断减少，24h-LC50是96h-LC50的3倍多;在亚硝酸氮暴露24h、48h、72h、96h后，其半数致死浓度分别为2.60(1.86-3.69)，1.86(1.54-2.77)，1.73(1.50-2.02)和1.58(1.29-1.94) mg L-1;随暴露时间的延长，48 h后其LC50值变化不大。实验结果表明，红螯光壳螯虾幼体对氨氮和亚硝酸氮毒性都较为敏感。 2.氨氮胁迫对红螯光壳螯虾幼虾抗氧化系统及Na+/K+ ATP酶活力的影响 在所求得96h LC50浓度的基础上，设置4个氨氦暴露浓度(4、8、12、16mgL-1 TAN)和一个对照组进行96 h的氨氮胁迫，探讨了氨氮毒性对红螯光壳螯虾幼虾肝胰腺抗氧化系统和鳃Na+/K+ ATP酶活力的影响。肝胰腺过氧化氢酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)活性随时间和氨氮浓度呈波动变化，并且在24h和48h具有相似的趋势，均在暴露于8 mg L-1 TAN24h后，表现出一个峰值。胁迫48h后，所有浓度处理组的SOD和CAT活性都未检测到显著性差异;96h后，SOD活性随着氨氮浓度的增加显著下降，而CAT活性保持不变。暴露24h后，任何处理组的肝胰腺丙二醛含量均无显著变化。而48h和96h时，丙二醛水平随氨氮浓度增加而增加。时间和氨氮浓度之间在对SOD，CAT活性及MDA水平上没有明显的相互作用。96h后，高氨氮浓度实验组中鳃Na+/K+ ATP酶活性显著地降低。实验结果表明，氨氮致死毒性可能与氧化损伤以及渗透调节的功能障碍有关。 3.亚硝酸氮胁迫对红螯光壳螯虾鳃中抗氧化酶相关基因表达量的影响 设置4个亚硝酸氮暴露浓度(0.5、1、1.5、2 mg L-1 NO2--N)和一个对照组进行48 h的亚硝酸氮胁迫，探讨了亚硝酸氮毒性对红螯光壳螯虾幼虾鳃中抗氧化相关酶的影响。经过12h胁迫，亚硝酸氮各处理组鳃cMnSOD、mMnSOD的基因mRNA的相对表达量都显著升高。exCu/ZnSOD的相对表达量在1.5和2 mg L-1NO2--N处理组显著升高。GPX的相对表达量在0.5和1 mg L-1处理组显著升高。GST的相对表达量在12 h胁迫后则没有发生显著的变化。24 h胁迫后，0.5、1和1.5 mg L-1 NO2--N处理组的cMnSOD和exCu/ZnSOD的表达量显著上升，mMnSOD的表达量在0.5和1 mg L-1 NO2--N处理组显著升高。GPX的表达量无显著变化，GST表达量则随着亚硝酸氮浓度的升高而升高。各抗氧化基因的表达量均有不同程度的升高，可能体现了“毒物兴奋效应”，是机体对外界胁迫的主动调节机制。48 h胁迫后，高浓度组亚硝酸氮处理组各抗氧化基因的表达量都出现了不同程度的降低。mMnSOD的表达量在2 mg L-1 NO2--N处理组显著低于对照组，其他基因在1.5和2 mg L-1 NO2--N处理组均显著低于对照组。此时抗氧化酶基因的表达量在高浓度亚硝酸氮处理组都显著降低，部分原因可能是由于亚硝酸氮胁迫对细胞造成的氧化损伤，使其基因表达量下降。另外由于长时间的亚硝酸氮胁迫能够氧化血蓝蛋白，造成机体处于相对缺氧的状态，无法充足的供给能量以转录这些基因应对抗氧化胁迫。自由基的性质极为活泼，过多的自由基将会攻击各种生物大分子，引起DNA损伤、蛋白变性、脂质过氧化等一系列氧化损伤，因此酶活水平的降低幅度可能将进一步大于其基因表达水平。 4.氨氮胁迫及其毒后恢复对红螯光壳螯虾相关免疫和代谢指标的影响 应用实时荧光定量PCR技术，结合生物酶和代谢的产物测定，研究了氨氮胁迫对红螯光壳螯虾免疫系统的毒性影响及其毒后恢复情况。实验首先进行3天的氨氮胁迫，取样后剩余虾移入曝气自来水进行7天的毒后恢复实验。结果表明，3天氨氮胁迫后，肌肉ACP、AKP、SOD活性表达均受到显著影响，随着氨氮浓度的升高而降低。胞质MnSOD、线粒体MnSOD、胞外Cu/ZnSOD的mRNA表达量也随着氨氮浓度增加而下降。CAT、GPX活性以及GPX和GST的mRNA表达量变化不显著。肝胰腺中可溶性蛋白和甘油三酯含量随着氨氮浓度升高而降低，AST活性在12 mg L-1浓度组显著升高。7天恢复期过后，ACP和AKP活性以及各代谢指标恢复到正常水平;而SOD和GPX活性高于对照组。各抗氧化基因的表达量都不同程度高于对照组。本研究表明，高浓度氨氮胁迫能抑制部分免疫相关酶的活性及其基因表达，从而对其免疫系统造成损害。氨氮胁迫下，红螯光壳螯虾动员蛋白质和脂肪来供能以应对胁迫。7天的恢复时间不足以让红螯光壳螯虾从胁迫中完全恢复，其肌肉仍处于轻度氧化应激状态。 5.不同氯离子水平下亚硝酸氮对红螯光壳螯虾幼虾免疫和代谢相关指标的影响 在10和60 mg L-1氯离子（氯化钠）水平下，各设定4个亚硝酸氮浓度梯度组(NO2--N=0、0.2、0.4、0.8 mg L-1)，探讨了氯离子水平对于亚硝酸氮对红螯光壳螯虾毒性的消减作用。实验结果表明，氯离子浓度的增加有效地降低了亚硝酸氮对红螯光壳螯虾的毒性作用，减弱了其抗胁迫反应。 10 mgL-1 Cl-水平下，亚硝酸氮胁迫24 h后，0.4 mgL-1浓度组中血淋巴葡萄糖含量显著提高;48h后，0.2和0.4 mgL-1实验组的葡萄糖含量均显著上升;亚硝酸氮胁迫72 h和96 h后，血淋巴葡萄糖含量也有升高的趋势，但差异不明显。所有亚硝酸氮实验组的肝胰腺糖原含量在胁迫24、48、72 h后都显著上升。0.4mgL-1实验组暴露96h后，血淋巴乳酸含量显著上升。在60 mgL-1 Cl-水平下，血淋巴葡萄糖含量仅在胁迫96 h后，在0.2和0.4 mgL-1实验组检测到显著升高(P＜0.05)。0.2 mgL-1实验组的糖原含量在胁迫0-48 h期间与对照组无显著差异;但暴露72 h后，所有亚硝酸氮实验组的血淋巴糖原含量均显著升高。0.4 mgL-1和0.8 mgL-1实验组在暴露72 h和96 h后，乳酸含量都显著升高。整个实验期间任何亚硝酸氮暴露实验组内均未检测到甘油三酯类含量发生显著变化。 10 mgL-1 Cl-水平下，亚硝酸氮胁迫24 h后，THC未发生显著变化;而胁迫48至96 h期间，THC随着亚硝酸氮浓度的升高而显著降低。48 h后，0.4 mgL-1实验组的肝胰腺SOD活性显著升高;72 h时0.2和0.4 mgL-1实验组的SOD活性显著高于对照组;胁迫96 h后，0.8mgL-1实验组SOD活性显著降低。60 mgL-1Cl-水平下，仅在胁迫72至96 h后，在0.8mgL-1实验组中THC含量明显下降，各浓度实验组中的SOD活性无显著差异。整个实验过程中肝胰腺CAT活性在两种氯化物水平下(10和60 mgL-1)，均无显著变化。 本研究结果表明，添加氯化钠能显著降低亚硝酸氮对红螯光壳螯虾代谢和免疫系统的胁迫。添加60 mg L-1氯化钠的添加能够防止0.2 mg L-1（NO2--N）亚硝酸氮对红螯光壳螯虾幼虾造成的大部分代谢和免疫的胁迫压力。生产中，尤其是小体积水体中，可以通过添加氯化钠来预防低剂量的亚硝酸氮污染对水生动物造成的危害。 6.红螯光壳螯虾血细胞原代培养体系的建立和优化 血细胞在虾蟹以及其它甲壳动物免疫防御中起着至关重要的作用。本文首次建立了一种体外培养红螯光壳螯虾血细胞的方法。在实验中选用抗凝剂anticoagulant citrate dextrose solution B(ACD-B)、phosphate buffered saline(PBS)和改良PBS，结果显示ACD-B的抗凝效果优于PBS。实验中选择了L-15培养基、2 L-15培养基、Grace培养基、DMEM培养基和(I)-max无血清培养基。结果显示，Grace培养基和L-15培养基较为适合红螯光壳螯虾血细胞的生长和存活，血细胞都能存活7天以上。但72h后，L15培养基中细胞状态优于Grace培养基。在L-15培养基和Grace培养基中，比较了不同浓度胎牛血清对血细胞生长状况的影响。10％、15％、20％的胎牛血清对红螯光壳螯虾血细胞的生长状况未见显著影响。在L-15和Grace培养基中，三种甲壳动物的细胞形态也有所不同。 7.氨氮毒性对红螯光壳螯虾原代培养血细胞相关免疫基因表达的影响 选取原代培养的血细胞进行氨氮的毒性研究，进一步在细胞水平上探索氨氮对甲壳动物的毒性机理，实验结果表明，24 h氨氮胁迫对原代培养血细胞各SOD基因(mMnSOD、cMnSOD、exCu/ZnSOD)的表达量都具有显著影响。24 h后，低浓度的氨氮胁迫(4 mg L-1)下，mMnSOD的mRNA表达量显著上调至约1.7倍。而在最高浓度组，mMnSOD表达量则显著下调。cMnSOD的mRNA表达量在8 mg L-1浓度组显著高于对照组，而在最高浓度组却显著低于对照组。exCu/ZnSOD的表达量变化和cMnSOD的变化相似。24 h的氨氮胁迫对原代培养血细胞的GPX、GST基因的相对表达量也具有显著影响。酚氧化酶原(proPO)表达量的变化规律与GPX相似。在体外培养的条件下不同类型的SOD基因表达量呈现相似的变化。低浓度的氨氮均能刺激其表达，而高浓度的氨氮则抑制其表达量。
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