摘要
目的: 目前为止，已确定的对人类有致病性的支原体主要有7种，分别为肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae, Mp)、解脲脲原体(Ureaplasma urealyticum, Uu)、人型支原体(Mycoplasma hominis, Mh)、生殖支原体(Mycoplasma genitalium，Mg)、发酵支原体(Mycoplasma fermentans, Mf)、穿通支原体(Mycoplasma penetrans, Mpe)和梨支原体(Mycoplasma pirum, Mpi)。除Mp外，其他6种均可通过性接触传播，其中Mf、 Mpe、Mpi及Mg被称为“艾滋病相关支原体”。目前国内外对于艾滋病相关支原体与HIV共感染问题的研究，或由于样本量太少而缺乏把握度大的结果，或注重体外实验研究，缺乏以人群为基础的研究结论，因此尚不能清楚阐明这些支原体在HIV感染者/AIDS病人中的感染情况及其与机体免疫指标变化之间的关联性。 对此，本论文的第一个研究目的是采用以人群为基础的流行病学研究方法，在全面了解HIV感染者和AIDS病人的支原体感染特征的基础上，进行有无支原体感染状态的比较，深入系统的分析多种艾滋病相关支原体与机体免疫指标的关联性，为阐明支原体在HIV感染及病程发展中的作用提供科学依据。目前，已有多种人类致病性支原体的全基因组测序工作陆续完成，但分离自HIV感染者且致病力较强的Mpi，却未见其完整基因组序列发布。因此，本论文的第二个研究目的是对Mpi进行全基因组测序，结合生物信息学方法，对其基因组结构进行注释，推测其临床株毒力、侵袭力，并且对部分临床株进行分型，为揭示Mpi的感染、致病及免疫机制奠定基础。 研究方法: 1、以江苏省疾病预防控制中心确认的男性HIV-1感染者/AIDS病人（文中简称为HIV/AIDS人群）为研究对象，采用重复横断面调查、随访队列研究及病例对照研究设计，在调查对象知情同意的基础上，分别进行4次流行病学调查、并采集首段尿、静脉血等样本。同时，在江苏省性病监测点开展哨点监测期间，纳入主动前来性病门诊就诊且被诊断为性病者及健康体检者为对照。对采集到的标本分别进行支原体检测及免疫指标检测。 2、用鉴定培养基进行Uu与Mh的初步分离和鉴定，并进一步经过滤培养和特异性 PCR试验进行确认;对艾滋病相关支原体Mg、Mf、 Mpe和Mpi采用套式PCR方法检测;利用流式细胞仪检测外周血CD4+T淋巴细胞，用ELISA法检测Th1/Th2细胞因子（包括IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α等）。 3、从GenBank基因数据库中下载支原体属内代表种的16S rRNA序列，用Mega5.1软件的多序列排列程序将部分Mpi临床株和下载序列进行同源位排列、比对，用Neighbor-Joining(N)构建系统发育树，并进行1000次Bootstraps检验。 4、采用Illumina Hiseq2000平台对标准株Mpi基因组进行测序，经数据清理后，使用短序列拼接软件SOAPdenovo进行拼接。由基因组拼接形成的Scaffold和小的Contig，利用基因组比对软件MUMmer将其比对到GenBank数据库中已公布的支原体基因组上，从而获得各Scaffold在基因组上的排列顺序。基因组的注释采用Glimmer软件，主要基于氨基酸序列比对，将基因的氨基酸序列与各数据库进行比对，得到对应的功能注释信息。利用perl语言编程将各类基因注释信息合并，并上传至GenBank数据库。比较基因组学研究利用软件IslandViewer，通用功能的比较基因组分析则通过病原与宿主互作数据库(PHI)及细菌致病菌毒力因子(VFDB)注释。 5、建立Epidata和Excel数据库，采用SPSS15.0统计软件，根据资料类型和分析需要，结合实验结果和流行病学调查资料，选用频数分布、中位数等描述性分析、x2检验、秩和检验、单因素、多因素Logistic回归、广义估计方程(GEE)等统计学方法对数据进行分析。 主要研究结果; 1、通过4次横断面调查，剔除重复检测的250人，本研究共收集1541名男性HIV感染者及AIDS病人，其中851(55.2％)人处于HIV感染阶段，690(44.8％)人已发展至艾滋病阶段。平均年龄为39.20(18～70)岁。53.7％的HIV感染者/AIDS病人正在接受高效抗逆转录治疗。在被调查对象中同性性接触和异性性接触感染HIV的分别占40.4％和43.3％。 2、在1541例男性HIV/AIDS人群中，6种可经性传播的支原体感染率分别为Uu26.7％(95％CI,25％～29％)、Mh25.3％(95％CI,23％～27％)、 Mg20.1％(95％CI,18％～22％)、Mf5.1％(95％CI,4％～6％)、Mpe1.6％(95％CI,1％～2％)和Mpi15.4％(95％CI,14％～17％)。且4次横断面调查时支原体感染率均有不同程度变化。在623名同性接触感染HIV的调查者中，4种艾滋病相关支原体的感染率分别为Mg17.7％(95％CI，15％～21％)，Mf5.1％(95％CI,3％～7％),Mpe2.4％(95％CI,1％～4％)和Mpi15.7％(95％CI,13％～19％)，与女性有过性接触史的MSM，其Mg感染率高于未接触者，而接受高效抗逆转录病毒治疗者，其Mg及Mpi感染率均低于未接受治疗者。在接受抗病毒治疗的828名HIV感染者/AIDS病人中，共发现88名耐药者，检出5种亚型，但艾滋病相关支原体感染率在各亚型HIV间未见统计学差异。 3、本次研究纳入的性病患者其支原体感染率分别为:Uu10.3％、Mh5.3％、Mg2.7％、Mf0.5％、Mpi2.8％，未检出Mpe;健康人群支原体感染率分别为:Uu8.5％、Mh1.4％、Mpi1.9％，未检出Mg、Mf和Mpe。相对于健康人群，HIV/AIDS人群及性病患者具有较高的支原体感染风险;而相对于性病患者，HIV/AIDS人群具有更高的支原体感染风险。 4、多因素logistic回归分析结果显示，在HIV/AIDS人群中，已婚、离异及丧偶者其支原体感染风险高于单身者(OR=1.432，95％CI:1.077～1.904);未接受高效抗病毒治疗者，其支原体感染风险高于已治疗者(OR=1.357，95％CI:1.097～1.679)。另外，随CD4+T细胞计数升高，支原体感染风险降低(OR=0.576，95％CI:0.460～0.719)。利用广义估计方程(GEE)校正年龄、文化程度、婚姻状况、性病史及HIV感染病程后，随访队列资料显示接受抗病毒治疗(OR=0.651，95％CI0.404～0.925)及CI4+T细胞计数≤350/μl(OR=1.901，95％CI1.428～2.875)与艾滋病相关支原体感染间存在独立统计学关联，前者降低感染风险，后者增加感染风险。 5、以CD4+T细胞计数350/μl为界将1541例HIV/AIDS人群分为两组，结果显示CD4+T细胞计数低于350/μl时Mg、Mpi感染率较高。在该人群中，艾滋病相关支原体阳性者其外周血IL-4、TNF-α的表达水平明显低于支原体阴性者(WIL-4=105120.5，P=0.013;WTNF-α=84005.5，P=0.016)。Mpi重叠HIV感染组的IL-2、IL-4水平低于健康组，IL-6、IL-10、TNF-α水平则高于健康组，差异有统计学意义。而单纯HIV感染组的IL-2、IL-4水平也均低于健康组，IL-6、TNF-α、IFN-γ水平则高于健康组，差异均有统计学意义。 6、以支原体为外群构建16S rRNA基因序列发育树，18株Mpi临床分离株几乎全部汇聚到一个分支，相似度达90％以上，且与本次测序Mpi标准株在同一分支。Mpe、Mg及猪Mp汇聚为一支，相似度达99％以上。推算出其p1基因编码的氨墓酸序列后，与其他支原体p1全序列进行同源性分析，发现Mpi p1预测氨基酸序列与Mpe HF-2同源关系较近。 7、基于测序数据组装得到Mpi基因组，其大小为850，704bp，GC含量24.21％。基因组组分分析发现，样品Mpi的基因组舍有708个基因，总长度为734，085 bp，平均长度1，037 bp，占基因组全长的86.29％。依照COG分类标准，708个基因分为19类，与KEGG数据库进行比对，则708个基因分为27个代谢途径，其中发现9类与人类传染病相关的致病基因，相关通路为7条。其中dnaK(Hsp70)为NLR激活的信号通路，其NOD2通路活化的是带有CARD结构域的丝/苏氨酸激酶RIP2，后者再激活转录因子NF-κB，使促炎症细胞因子发生转录激活。 8、通过PHI数据库的比较基因组注释，发现了基因组中对化学药物敏感的DNA旋转酶(GyrA)，是DNA复制起始中不可缺少的酶。本次注释的C(l)pC基因与支原体黏附、侵袭有关，而Hsp60基因则与支原体黏附宿主细胞有关。SigA基因与转录激活因子WhiB3相互作用，促进毒力相关基因表达，是唯一具有α螺旋-转角-α螺旋基序的蛋白质(helix-turn-helix,HTH)。 主要研究结论: 1、本次调查的1541名江苏省男性HIV/AIDS人群，艾滋病相关支原体中的Mg、Mpi感染较高，应在艾滋病防治工作中引起注意。接受抗病毒治疗以及机体CD4+T细胞计数保持较高水平，可降低艾滋病相关支原体的感染风险。 2、艾滋病相关支原体，尤其是Mpi的感染与HIV/AIDS人群血清中IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ、TNF-α等多种细胞因子的含量相关，从而与Th1/Th2型细胞因子的动态稳定及机体免疫状况相关联，为进一步研究支原体对艾滋病病程的影响机制提供了科学依据 3、根据16S rRNA基因序列，由HIV/AIDS人群中分离的Mpi属于按肺炎支原体(Mpn)所定义的同一种系发育的家族成员，且采用来自Mpn主要黏附素基因保守区的基因探针从Mpi基因组中分离到了p1样黏附素基因片段。可利用生物信息学方法对Mpip1基因序列及核苷酸序列进行生物信息学预测分析，进而为研究该物种的致病因子提供靶向信息。 4、首次完成对标准株Mpi的全基因组序列测定(注册序列号为: AZHZ00000001)，获得了基因草图且对基因组进行了注释和部分代谢途径分析。基于测序数据注释其COG及KEGG已知蛋白编码序列，探索并获得了部分新基因的功能，尤其是与支原体粘附、侵袭相关的C(l)pC基因、Hsp60基因以及SigA基因等，特定的毒力相关基因的功能的筛选鉴定也可以为进一步研究病原菌与宿主互作、深入了解病原菌的抗性机制筛选靶标。
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