毕赤酵母不同启动子的作用特点及在HPV16 L1表达中的应用

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中文摘要：研究目的: 探讨不同毕赤酵母启动子在不同培养条件下控制异源蛋白表达的特点;探讨不同启动子及其组合应用对人乳头瘤病毒16型L1蛋白(HPV16 L1)表达的影响;此外，探讨通用质粒载体系统在毕赤酵母和汉逊酵母间的穿梭表达应用。本研究致力于从启动子合理应用角度，优化异源蛋白在酵母中的表达与制备。研究方法: 以毕赤酵母GS115基因组为模板，经PCR扩增获得PTEF1和PFLD DNA片段，经基因重组分别替换商业化的毕赤酵母载体pPink-LC和pPink-HC中的PAOX1，以绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因;在不同碳源（葡萄糖、甘油、甲醇、山梨醇）背景下探讨PTEF1指导异源蛋白表达的水平以及与不同碳源利用及菌体生长状态的相关性，此外，考察PTEF1指导HPV16 L1表达的情况;通过不同碳、氮源的组合，探讨PFLD指导GFP及HPV16 L1表达的特点;通过构建PAOX1和PTEF1双启动子表达载体，或多次转化整合两个表达单元于同一染色体中，探讨启动子联合应用对提高HPV16 L1表达水平的影响;通过构建基于汉逊酵母rDNA序列以及汉逊酵母、毕赤酵母来源的不同启动子的通用表达载体，分别转化毕赤酵母和汉逊酵母，探讨其介导在两个宿主系统中的基因整合及蛋白表达。研究结果: 组成型的PTEF1在以葡萄糖(Glu)或甲醇(M)作为碳源的培养条件下，24h可获得GFP及HPV16 L1的高效表达，之后蛋白表达量急剧下降，而在甘油(Gly)或山梨醇(Sor)培养基中获得了持续高水平表达。以葡萄糖及甘油为碳源的菌获得了更快的生长速率;PFLD在Sor+NH4+、Sor+ MA、M+NH4+和M+MA四种组合诱导培养基中，在24h、48h、72h都获得高效表达，在M+ NH4+和M+MA中表达量最高，而在Glu+NH4+、Glu+MA、Gly+ NH4+和Gly+ MA中则仅获得较少或无明显蛋白表达;PAOX1和PTEF1启动子控制的表达单元可共表达GFP和/或HPV16 L1，但蛋白水平较之单个表达单元有所下降;汉逊酵母的rDNA及自主复制序列(ARS)可介导质粒在毕赤酵母和汉逊酵母中的转化，但转化及整合效率在毕赤酵母中较低，通过无抗性压力多次传代结合抗性筛选，含有汉逊rDNA的质粒能够稳定整合于毕赤酵母染色体基因组中;启动子PMOX以及PAOX1和PTEF1可在两个宿主系统中工作;通用载体介导了GFP及HPV16 L1在两个酵母系统中的有效表达。研究结论: 本研究应用不同启动子在毕赤酵母中成功实现了异源蛋白的表达;显示了不同培养条件对启动子作用及蛋白表达具有显著影响;证实不同启动子控制的多表达单元可实现目的蛋白共表达，但存在相互干扰现象;构建了可介导在毕赤酵母和汉逊酵母中穿梭表达的通用载体系统。研究通过启动子的合理应用，实现了HPV16 L1高效表达，有助于低成本、多价HPV疫苗研发;此外，为基于酵母系统的基因重组蛋白的表达与制备提供了一种有效的优化策略。

作者：

金晓媚

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关键词：

毕赤酵母汉逊酵母启动子人乳头瘤病毒主要衣壳蛋白L1 蛋白表达基因重组优化策略

授予学位：

硕士

学科专业：

生物化学与分子生物学

导师：

马雁冰

学位年度：

2014

学位授予单位：

北京协和医学院中国医学科学院

语种：

中文

中图分类号：