摘要
研究背景： 非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease，NAFLD)是一类以肝细胞非酒精性脂肪性变性为核心，非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis，NASH)为特点的肝细胞脂代谢紊乱性疾病。近年来，NAFLD发病率迅速上升，而现代医学针对性治疗手段却相对不足。中医药治疗NAFLD有独特的优势和疗效，较多的中药及中药复方具体治疗NAFLD的作用，我科研究开发的复方“甘枣宁颗粒”经实验研究对NAFLD形成具有一定的预防和治疗作用，但方中发挥作用的主要成分及机制尚未完全阐明。该方中君药山药（薯蓣）具有补脾养胃，生津益肺，补肾涩精等功效。同时，既往研究发现，薯蓣具有降低血脂的作用，而且薯蓣的有效成分之一，薯蓣皂苷元具有调节血脂代谢的作用，提示其可能是“甘枣宁颗粒”中薯蓣发挥抗NAFLD作用的主要成分之一。 研究目的： 通过体内外实验研究薯蓣皂苷元对NAFLD形成的作用，从调控脂代谢相关腺苷酸活化蛋白激酶(Adenosine Monophosphate Activated Protein Kinase，AMPK)通路和肝X受体α(Liver X Receptorα，LXRα)探讨其抗NAFLD的作用机制。 实验方法： 体外实验: 使用HepG2细胞，10％ FBS+低糖DMEM（葡萄糖浓度:1.0g/L）培养。 (1)正常培养的HepG2细胞，传代铺板，待细胞贴壁后，弃上清，加入无血清低糖DMEM培养基，饥饿12h后，再弃上清，将含有不同浓度薯蓣皂苷元的无血清低糖DMEM加入培养24 h，蛋白印迹法（Westernblot，WB）检测AMPK和乙酰辅酶A羧化酶(Acetyl-CoA，ACC)磷酸化水平。 (2)正常培养的HepG2细胞，传代铺板，待细胞贴壁后，弃上清，加入无血清低糖DMEM培养基，饥饿12h后，再弃上清，将含有不同浓度薯蓣皂苷元的无血清高糖（糖浓度:4.5g/L）DMEM加入刺激24h，酶法检测在不同浓度薯蓣皂苷元干预下（0、5、10、25、50、100μM）HepG2细胞甘油三酯水平。 (3)正常培养的HepG2细胞，传代铺板，待细胞贴壁后，弃上清，加入无血清低糖DMEM培养基，饥饿12h后，再弃上清，将含有25μM浓度薯蓣皂苷元以及AMPK通路的抑制剂1μMCompound C的无血清高糖（糖浓度:4.5g/L）DMEM加入刺激24 h，酶法检测HepG2细胞甘油三酯水平。 (4)正常培养的HepG2细胞，传代铺板，待细胞贴壁后，弃上清，加入无血清低糖DMEM培养基，饥饿12h后，再弃上清，将含有25μM浓度薯蓣皂苷元以及LXRα受体激动剂T0903171μM的无血清低糖DMEM加入刺激24h，酶法检测HepG2细胞甘油三酯水平。 体内实验: 将40只成年雄性SD大鼠（250±20g）随机分为空白对照组、模型组、薯蓣皂苷元低剂量组、薯蓣皂苷元高剂量组、非诺贝特组，每组8只。空白对照组给予普通饲料，模型组给予高脂饲料（脂肪供能45％），高低剂量薯蓣皂苷元组给予含药高脂饲料（高剂量薯蓣皂苷元组:饲料中薯蓣皂苷元含量为1％;低剂量薯蓣皂苷元组:饲料中薯蓣皂苷元含量为0.5％），非诺贝特组给予含有非诺贝特的高脂饲料（每公斤饲料中含200mg非诺贝特），饲养16周（食量:25g/只·天）。 饲养16周后，大鼠称重，眼眶取血后处死大鼠，取肝脏待用。 (1)油红O染色检测大鼠肝细胞内甘油三酯沉积;HE染色检测大鼠肝细胞内脂肪变性情况。 (2)实时荧光定量PCR(Real time PCR，RT-PCR)检测肝脏内脂代谢相关基因固醇调节元件结合蛋白家族(Sterol Regulatory Element Binding Protein，SREBPs)，过氧化物酶体增殖物激活受体家族(Peroxisome Proliferator Activated Receptor，PPARs) mRNA表达水平。 (3)Western Blot检测AMPK，ACC，LXRα表达水平。 (4)全自动生化仪检测血清天门冬氨酸氨基转移酶，丙氨酸氨基转移酶，甘油三酯，总胆固醇，高密度脂蛋白，低密度脂蛋白。 研究结果： 体外实验: (1)使用高糖DMEM刺激后，HepG2细胞内甘油三酯水平显著升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。薯蓣皂苷元能够有效抑制HepG2细胞内TG沉积，同模型组相比，差异有统计学意义(P＜0.01)。 (2)高低糖环境下，HepG2细胞经不同浓度薯蓣皂苷元作用24h后，Western Blot结果显示磷酸化的AMPK水平和磷酸化的ACC的水平显著升高。 (3)低糖环境下，加入LXRα受体激动剂T090317后，与低糖组相比，T090317能有效升高HepG2细胞内甘油三酯水平，差异有统计学意义(P＜0.05)。同T090317相比，薯蓣皂苷元联合T090317能降低HepG2细胞内甘油三酯水平，差异有统计学意义(P＜0.05)。 (4)高糖环境下，加入AMPK通路抑制剂Compound C后，与低糖组相比，高糖组HepG2细胞内甘油三酯水平上升，差异有统计学意义(P＜0.01)。同高糖组相比，25μM薯蓣皂苷元组HepG2细胞内甘油三酯水平下降，差异有统计学意义(P＜0.01)。与25μM薯蓣皂苷元组相比，25μM薯蓣皂苷元组联合1μM Compound C组HepG2细胞内甘油三酯水平上升，差异有统计学意义(P＜0.01)。 体内实验: (1)与空白对照组相比，模型组大鼠末次体重及肝湿重明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01)。薯蓣皂苷元高剂量组及低剂量组大鼠体重及肝重显著低于模型组，差异有统计学意义(P＜0.01)。非诺贝特组体重及肝重低于模型组，差异有统计学意义(P＜0.01)。 (2)油红0染色及HE染色发现，模型组大鼠肝细胞脂肪变性明显，证明造模成功，薯蓣皂苷元高剂量及低剂量组与模型组相比，肝细胞内甘油三酯沉积、肝细胞脂肪变性明显减轻。 (3)与空白对照组相比，模型组大鼠血清甘油三酯水平明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01);非诺贝特组血清甘油三酯水平明显低于模型组，差异有统计学意义(P＜0.01)，薯蓣皂苷元高剂量组和低剂量组大鼠血清甘油三酯水平显著低于模型组大鼠，差异有统计学意义(P＜0.01)。 (4)与空白对照组相比，模型组大鼠肝脏内甘油三酯含量明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01);非诺贝特组肝脏甘油三酯含量显著低于模型组，差异有统计学意义(P＜0.01);薯蓣皂苷元高剂量及低剂量组肝脏甘油三酯水平显著低于模型组及非诺贝特组，差异有统计学意义(P＜0.01)。 (5)与空白对照组相比，模型组SREBP1C mRNA表达明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01)，薯蓣皂苷元高剂量及低剂量组SREBP1C mRNA表达低于模型组，差异有统计学意义(P＜0.01);与空白对照组相比，模型组PPARα mRNA表达明显下降，差异有统计学意义(P＜0.05)，薯蓣皂苷元高剂量及低剂量组PPARα mRNA表达高于模型组，差异有统计学意义(P＜0.01)，非诺贝特组PPARα mRNA表达明显高于模型组，差异有统计学意义(P＜0.01)。 (6)与空白对照组相比，模型组AMPK磷酸化水平显著下降。薯蓣皂苷元高低剂量组AMPK磷酸化水平高于模型组。 (7)与空白对照组相比，模型组LXRα蛋白水平上调，薯蓣皂苷元高剂量及低剂量组LXRα蛋白表达水平显著低于模型组。 (8)与空白对照组相比，模型组水丙氨酸氨基转移酶平明显升高，差异有统计学意义(P＜0.01)，非诺贝特丙氨酸氨基转移酶水平明显高于模型组，差异有统计学意义(P＜0.01)，薯蓣皂苷元高剂量及低剂量组丙氨酸氨基转移酶水平明显低于模型组及非诺贝特组，差异有统计学意义(P＜0.01)。 结论： (1)薯蓣皂苷元能改善高脂饮食诱导下大鼠NAFLD形成; (2)薯蓣皂苷元通过激活AMPK相关信号通路，抑制LXRα发挥抗大鼠NAFLD作用; (3)薯蓣皂苷元能改善高脂饮食引起的大鼠肝功能损害。
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