摘要
近年来，随着单个B细胞分离技术的发展，从人免疫缺陷病毒Ⅰ型（humanimmunodeficiency virus-1，HIV-1）感染病人样本中分离和鉴定到许多新型HIV-1广谱高效中和单克隆抗体（broadly neutralizing antibodies，bNAbs）。和治疗HIV-1抗逆转录的小分子药物相比，bNAbs具有更安全、更长半衰期和更高效等特点，是新一代HIV-1预防和治疗药物的代表。目前，ibalizumab(iMab)和PRO140已在美国完成了治疗HIV-1的二期临床实验(PhaseⅡ)，效果良好，PGT128也在人猴嵌合艾滋病毒毒株（Chimeric Simian/human immunodeficiency virus，SHIV）/猕猴模型的粘膜感染中发挥了被动免疫的保护作用。 然而，尽管bNAbs具有极大潜力，但抗病毒广度的局限性，是其对抗HIV-1及变种的一个限制因素。研究表明，虽然单独使用几种bNAbs时，能够保护动物免遭HIV-1感染，但对已建立的感染则效力有限，尤其在接受单抗治疗的病人中，由于存在或出现病毒逃逸型突变体，几乎所有患者在使用单抗治疗一段时间后，体内都会出现病毒载量的反弹。新的策略是组合不同靶点、不同作用机制的多个HIV-1中和抗体，以增加治疗过程中的抗病毒效力。目前，探索广谱高效的中和抗体及其组合方式应对包括逃逸突变体在内的多种病毒，成为抗HIV-1的重点研究方向。 本研究中，基于HIV-1感染细胞的特点和中和抗体iMab抗病毒的独特机制，结合抗体联合用药的抗病毒疗效，以增强中和抗体的活性和广度、提高非敏感病毒的逃逸难度及对抗逃逸型病毒突变株生成为目的，我们设计并制备了一种新型的双特异性抗HIV-1中和抗体（bispecific broad neutralizing antibody，bibNAb）——iMabm36。在全面评估了iMabm36抗HIV-1的中和活性和广度，理解了其抗病毒的基本作用机制，分析了其非敏感毒株的主要特点之后。以此为基础，我们继续优化了该双特异性抗体，抗病毒的活性得到进一步提高，从理论上证明基于作用机制设计的新型中和抗体（双特异性抗体）和优化策略的可行性，为HIV-1中和抗体的研究提供了有价值的参考。 首先，我们设计并制备了iMabm36，该抗体是抗CD4抗体iMab连接两个拷贝靶向高度保守的CD4诱导(CD4i)表位的单域抗体m36组成的融合抗体。iMabm36具有高效广谱抑制HIV-1的中和活性，全球HIV-1特征病毒库(N=118)的抗病毒活性检测结果显示，它能以低于10μg/mL的50％抑制浓度(50％inhibitory concentration，IC50)中和大多数(96％)的主要HIV-1毒株;能以低于0.1μg/mL的IC50中和83％的HIV-1毒株。在PBMC为基质细胞的中和实验中，iMabm36能以低于0.1μg/mL的浓度完全中和一系列的复制性传播始祖病毒株(replication-competent transmitted-founder viruses)和SHIVs(SHIV SF16233A和SHIV P3N)，而且，iMabm36对T细胞与T细胞之间的胞间感染也具有很好的抑制活性，最大抑制百分比(Maximal inhibition percentage，MPI)达到95％以上。在抗病毒机制的研究中，我们发现iMabm36增强的抗病毒活性协同效应同时依赖于iMab与CD4的结合、m36与CD4i表位的结合，其通过增强病毒侵入细胞路径上m36的局部浓度，消除影响m36靶向特异性表位的空间限制，促使iMabm36分步对两个空间关联但完全不同的病毒感染细胞步骤进行抑制。在全面分析iMabm36中和病毒库的特征后，我们发现iMabm36的非敏感型病毒主要集中在HIV-1的A和G亚型，非敏感性由病毒gp120桥连片(bridging sheet)的氨基酸突变位点所致，通过制备病毒突变体和后续的中和检测，明确了桥连片上β3和β21突变位点的重要性（可能是m36的表位之一）。 最后，基于上述分析结果，结合CD4i抗体和共受体结合的特点，我们将m36进一步抗体工程化，通过对重链互补决定区(complementary-determining region，CDR)的合理置换，改造出新的m36，并将新m36重新融合到iMab上得到了iMabm36opt，该改良抗体能进一步中和iMabm36的一系列非敏感型病毒，最大抑制百分比可达到86-98％。 综上所述，该双特异性抗体利用内部两个因子相互依赖的双重抗病毒机制使其具备了高效抑制HIV-1感染的中和活性，同时也提示我们基于作用机制来设计的双特异性抗体，可以产生用于防治艾滋病的新型候选药物。
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