冬小麦低温下基因表达谱分析及海藻糖基因家族研究

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中文摘要：温度是限制作物地理分布和生长发育的主要因素之一，低温会给作物的产量造成巨大损失。小麦是世界上主要的粮食作物，但也是受低温影响严重的作物，低温极大的限制了小麦在高纬度地区的分布。实践证明，选育抗寒小麦品种不仅可以降低低温造成的减产，而且是发展高寒地区小麦种植的有效手段。因此，研究小麦的抗寒机制以及对抗寒基因转录的整体水平进行探索，对于全面了解小麦的抗寒分子基础以及培育抗寒新品种具有重要意义。本研究以强抗寒品种东农冬麦1号和弱抗寒品种济麦22为试验材料，分别在4℃6h、4℃30d和-12℃6h三个低温处理下进行分蘖节取材，采用Solexa高通量测序技术进行转录组分析，从中筛选出大量的差异表达基因及重要的代谢途径。为了进一步验证表达谱中两个冬小麦品种的差异代谢途径抗寒性的影响，在室外自然降温过程中对两个品种分蘖节的生理指标及膜质脂肪酸含量进行了比较分析，对外源施加海藻糖对冬小麦抗寒性的影响进行了研究，并在-20℃处理条件下对两个品种的海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)家族基因进行了荧光定量PCR分析。本研究为小麦抗寒遗传改良提供了基因资源，也为进一步了解冬小麦越冬分子机制奠定基础。主要研究结果如下: 1.利用Solexa/Illumina测序平台，共获得224886 contigs，平均长度为272nt，N50长为378。经过聚类，contigs被进一步组装成unigenes，数量为80704，平均长度为686nt，N50长为1036nt。大约有64％的unigenes被比对到了Nr数据库中。而16551个unigenes没有与任何序列比对上。A1A、A2B、A3B和B3A的clean reads数目达到2.5M时，B1A和B2达到2M时，检测到的基因数目几乎趋于饱和，基本不在上升，说明这些样本的测序量已经基本覆盖到了取样部位细胞中正在表达的全部基因。 2.为了验证数字表达谱测序结果中基因表达量的准确性，运用RT-PCR对随机选取的差异表达基因进行了表达量的分析。8个随机差异unigenes的24个数据点中有19个表达趋势及方向与表达谱的结果一致，一致度达到79％。由此证明Solexa测序的结果达到了进一步试验分析的要求。 3.通过对三个低温处理下两个冬小麦品种差异表达基因的分析，发现符合FDR≤0.001且|log2Ratio|≥2的差异表达基因有6471个。三个低温处理共有的差异表达基因439个，且在东农冬麦1始终上调表达且被注释功能的基因共有27个，其中被注释为碳水化合物代谢过程的unigene33313_B2和NBS-LRR抗病蛋白功能的unigene39910_B2以及细胞质囊功能的unigene49064_B2等三个基因在三个低温处理下的表达量在东农冬麦1号中均比济麦22上调了10倍以上，另外还有17个unigenes在驯化时期在东农冬麦1号中的表达量比济麦22上调了10倍以上，而进入冷冻期这些基因的表达量开始下降，但是仍高于济麦22。这些基因多被注释为结合功能、激酶活性、逆境响应、氨基酸蛋白激酶和抗病蛋白等功能。 4.经过GO分析，有22724个序列在GO数据库中具有注释，而这些序列又进一步被分配到生物过程、细胞组件和分子功能等子集中，其中大多数unigenes功能集中在生物过程的细胞过程和代谢过程，细胞组件的细胞、细胞部分和细胞器，分子功能的结合和催化活性等生物学过程。在此基础上分别对三个低温下的分子功能部分进行了分析，并且以corrected p-value≤0.05为阈值，两个冬小麦品种在经历4℃驯化6h和4℃驯化30d两个处理时GO注释得到的基因功能分类明显少于-12℃处理6h，且在前两个处理(4℃)下结合活性较-12℃处理显著富集。而在植株经历-12℃处理后，抗氧化活性和离子结合等能力明显增强。并且抗氧化活性、氧化还原酶活性和糖基转移酶活性等三个与低温抗性密切相关的子集仅在-12℃处理下被注释到。 5.18764个序列经过COG分类后被聚成25类，注释为一般功能的unigenes有7151个，在25类中比例最高达到38.11％，而细胞外结构和细胞核结构比例最低分别为0.04％和0.01％，unigenes数量分别为24和7个。其中被注释为与脯氨酸代谢有关的氨基糖转移和代谢的unigenes有2128个;与可溶性糖代谢有关的碳水化合物转移和代谢的unigenes有3408个;与细胞膜脂不饱和脂肪酸代谢有关的脂质转移和代谢和细胞膜/外膜的unigenes分别有1713和4207个。 6.对三个低温处理组进行pathway分析后，分别鉴定出113、103和100条pathway，且分别注释到1519、995和732个差异基因。通过比较三个低温处理下基因显著富集pathway的结果，发现氨基糖和核苷酸糖代谢、淀粉和蔗糖代谢、氧化磷酸化、半乳糖代谢、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢及甘氨酸，丝氨酸和苏氨酸代谢等6条pathway在东农冬麦1号经历-12℃处理6h后显著富集，这些pathway与植物抗逆密切相关。 7.对两个冬小麦品种表达谱中的差异基因进行功能分类，发现被注释为转录因子功能的unigenes共有51个，其中CBF的19个，WRKY有16个，ERF有6个，MYB有5个，NAC有3个还有2个Zinc-finger;被注释为抗病蛋白NBS-LRR的有24个unigenes，RGA的有9个，抗病蛋白有11个，病程相关蛋白有2个;被注释为逆境响应蛋白膜蛋白有8个unigenes，冰再结晶阻遏蛋白有9个，WCOR有6个，热激蛋白有2个，诱导响应蛋白有2个以及1个脱水蛋白;被注释为谷胱甘肽-抗坏血酸循环关键酶共有21个unigenes;被注释为糖代谢关键酶的糖基转移酶有49个，葡聚糖酶有9个，葡萄糖-6-磷酸脱氢酶有3个;注释为脂肪酸合成及降解的unigenes共有19个，其中脂肪氧合酶有10个，磷脂酶A有4个，FabF有2个，FabG有2个，FabI有1个。 8.因为在前期的数字表达谱分析中发现两个冬小麦品种在低温下的很多代谢途径都存在差异，所以为了更进一步的洞察东农冬麦1号和济麦22两个抗寒性不同的品种的遗传差异。对两个品种在低温下的一些抗寒生理指标进行了测定，在室外自然降温的过程中可溶性糖和脯氨酸在东农冬麦1中含量明显高与济麦22，说明它们在东农冬麦1中起到了更强的渗透调剂作用，从而增加了分蘖节的保水能力，降低了质膜的过氧化程度进而降低丙二醛含量。 9.对冬小麦低温下数字表达谱分析发现，某些脂肪酸代谢途径相关基因的表达量在两个品种中表现出明显差异。所以对低温下冬小麦的膜脂脂肪酸含量及组分配比进行了测定分析，东农冬麦1号的不饱和脂肪酸含量高于济麦22，这进一步说明了极端低温下东农冬麦1号的膜脂稳定性高于济麦22。 10.通过对低温下冬小麦幼苗外源施加海藻糖，发现适当浓度的外源海藻糖可以在一定程度上提高冬小麦的抗寒性。鉴定了9个小麦海藻糖-6-磷酸合成酶(TPS)基因并对它们的结构、进化及功能进行了分析。9个TaTPS基因中均包含HAD-like domain、UDP-forming、20Glyco_transf_20和Trehaiose_Ppase4个保守结构域。 11.经过比较发现小麦和水稻的TPS在进化树中关系较近，其中OsTPS2 vs.TaTPS8，OsTPS4vs.TaTPS4、5，OsTPS5 vs.TaTPS9在进化树中分别被分在同一个亚组之中，相对应的两个物种的TPS基因可能具有相同或相似的生物学功能。 12.在-20℃冷冻条件下分析了两个冬小麦品种中9个TaTPS基因的表达模式，TaTPS1、3、7、8、9在东农冬麦1号的根、茎中各时间点均表现出上调表达，对东农冬麦1号的抗寒性起到重要的作用。TaTPS8在济麦22的根、叶中保持上调表达;TaTPS4和TaTPS7在济麦22的茎中各时间点也都表现出上调表达，但是上调并不显著。

作者：

谢冬微

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关键词：

冬小麦海藻糖-6-磷酸合成酶基因表达谱抗寒基因

授予学位：

博士

学科专业：

作物学;作物遗传育种

导师：

李卓夫

学位年度：

2014

学位授予单位：

东北农业大学

语种：

中文

中图分类号：