摘要
柱状黄杆菌（Flavobacterium columnare）是鱼类柱形病（Columnaris disease）的病原，可感染野生及养殖鱼类。柱形病会使鱼类烂鳃、体表溃疡、皮肤坏死和鳍条腐烂，导致极高的死亡率并带来巨大的经济损失。 对柱状黄杆菌毒力因子的研究有利于阐述其致病机理。本研究从实验室构建的柱状黄杆菌G4菌株基因组注释中对溶血素基因进行了搜索和分析，对两个溶血素基因hly0611和hly2031的特性进行了初步研究。 研究中，hly0611基因的侧翼序列经扩增后与实验室构建的自杀质粒pMS75相连，重组质粒通过接合转移进入野生型G4菌株内。利用同源重组及蔗糖负选择的方法成功筛选到溶血素基因hly0611的缺失突变株△hly0611。将G4菌株和突变株△hly06H分别孵育红细胞比较两者对红细胞的裂解能力。研究发现，△hly0611裂解红细胞的能力与G4相比有所下降但差异并不显著。在后续研究中除了改进溶血实验条件外，还需验证突变株的功能。 同源性比对发现，hly2031基因编码的溶血素蛋白与柱状黄杆菌ATCC49512溶血素、嗜冷黄杆菌溶血素相似性很高分别达到100％和92％。虽然进行了突变株的大量筛选工作，但并未得到hly2031基因的缺失突变株。该基因经酶切后连接到表达载体pQE30上并转入大肠杆菌内进行表达，经SDS-PAGE电泳后显示重组蛋白在70kDa处有明显表达条带并与预期分子量大小一致。将纯化后的重组蛋白免疫家兔制备了相应的多克隆抗体。经Western blot检测，该溶血素在柱状黄杆菌的全菌蛋白和胞外蛋白中都存在，是一种分泌型蛋白。但该蛋白分泌至胞外后的功能还有待进一步的研究。
NETL