摘要
植物花青素的合成受到两类基因的调控，一类是结构基因，编码催化花青素生化反应的酶类，如二氢黄酮醇还原酶基因（DFR）、花青素糖基修饰酶基因(3GT);另一类是调节基因，其编码的转录因子调控结构基因的时空表达，如控制玉米叶色的基因Lc(leaf color)。虽然花青素的合成途径在模式植物拟南芥、金鱼草和矮牵牛中的研究较为深入，但是紫薯花青素的代谢调控机制还不清楚，很多结构和调节基因尚未被克隆。因此本论文主要针对紫薯花青素合成、修饰及调控三个方面来研究花青素的代谢与调控机制，解析其生物学功能。 DFR是花青素合成的一个关键酶，它催化二氢黄酮醇生成无色的花色素。我们克隆了紫薯Ayamurasaki的IbDFR基因，分析表明该基因在紫薯不同发育时期的叶、茎、根中的表达有显著差异，并与花青素的累积呈明显正相关。在拟南芥突变体tt3中过表达IbDFR基因能完全互补种皮、子叶和下胚轴色素减少的表型。同时我们利用小分子RNA手段干扰紫薯内源IbDFR基因的表达，对转基因株系(DFRi)分析表明，DFR基因的转录水平明显受到抑制，其叶、茎、根中花青素含量也明显减少，原花青素含量降低;与之相反，黄酮醇类物质的含量显著升高，如槲皮素-3-O-双己糖和槲皮素-3-O-葡萄糖，说明干扰紫薯IbDFR的表达，影响了类黄酮类物质的代谢流分配，代谢流更多的流向黄酮醇的合成，并且DFR与负责黄酮醇合成的酶基因(FLS)存在底物竞争性。逆境胁迫条件下，DFRi植株中由于花青素的含量降低导致抗氧化、低温等能力明显减弱。冷处理后叶片的离子渗透率和过氧化氢的含量在DFRi转基因植株中显著高于野生型。这些实验结果直接证明了紫薯花青素具有抗氧化和抗逆的功能。因此，本研究表明IbDFR基因不仅在类黄酮类物质的代谢中起作用，而且也证实了花青素通过清除活性氧来保护植物免受胁迫的伤害。 紫薯和拟南芥中花色苷合成后的第一步都是经过糖基化形成花青素-3-O-葡糖苷，但进一步的糖基化修饰完全不同。在拟南芥中，一个木糖苷在糖基转移酶At3GGT(UGT79B1)的催化下转移到花青素-3-O-葡糖苷C2位上;而紫薯中可能是一个葡糖苷在糖基转移酶的催化下转移到花青素-3-O-葡糖苷C2位上形成花青素-3-O-槐糖苷，我们克隆了催化此步骤的糖基转移酶(UDP-glucose:anthocyanidin3-O-glucoside-2”-O-glucosyltransferase)基因Ib3GGT(GenBank登录号:ABL74480)。酵母中表达Ib3GGT蛋白的粗提物能催化底物矢车菊素-3-O-葡糖苷和尿苷二磷酸葡萄糖(UDPG)生成矢车菊素-3-O-槐糖苷，该酶具有底物专一性，对不同花青素类底物矢车菊素或矢车菊素-3，5-O-葡糖苷或黄酮醇类底物槲皮素-3-O-葡糖苷都没有催化活性。因此，Ib3GGT很可能特异地催化矢车菊素-3-O-葡糖苷的进一步糖基化。并且拟南芥中过表达Ib3GGT基因时，LC-MS检测到转基因植株中新组分矢车菊素-3-O-槐糖苷的生成。综上所述，可见Ib3GGT以花青素-3-O-葡糖苷为受体，以UDPG为供体合成花青素-3-O-槐糖苷，行使糖基转移酶功能。紫薯和拟南芥中花青素修饰方式的不同最终导致了两种植物花青素主要成分的巨大差别，这为我们深入理解植物次生代谢的演化奠定了基础，同时也为通过基因工程生产特定花青素提供了思路。 多种转录因子可调控花青素的合成，Lc是调控花青素结构基因表达的MYC类转录因子。我们的研究表明，在紫薯中异源表达玉米来源的Lc不仅可提高全株花青素的富集，而且会导致储藏根变小、产量降低和淀粉含量下降。RT-PCR分析表明Lc转基因甘薯根中PAL的表达显著上调，木质素合成相关的结构基因4CL、C4H在转录水平也明显提高，导致其储藏根中木质素的含量明显高于野生型。另一方面，虽然转基因和野生型甘薯的储藏根含水量相同，淀粉合成关键基因AGPase的表达水平也无明显差异，表明其淀粉合成能力一致，但转基因甘薯中β-amylase的表达明显提高，说明其淀粉降解速度增加，推测这主要为木质素合成提供所需要的能量和碳源。甘薯储藏根发育的基础代谢调控一直是值得关注的问题，最近的转录谱数据分析表明甘薯储藏根的早期发育过程中涉及木质素合成的下调和淀粉合成的上调，但缺乏有力的实验证据来支持这两者互作对储藏根发育的直接影响。我们的研究为解析储藏根发育的分子调控机制奠定了基础。 本论文对紫薯花青素合成、修饰及调控进行系统的研究，对花青素合成关键结构基因DFR的研究表明，干扰其功能可降低花青素的富集并分流促进黄酮醇的富集，降低植株对逆境胁迫的抗性。同时解析了紫薯花青素糖基化修饰过程中花青素-3-O-槐糖苷的关键酶Ib3GGT的功能，证明该酶是催化紫薯花青素特有糖基化修饰的糖基转移酶。在花青素生物合成的调控方面，研究表明过表达玉米Lc转录因子不仅能提高花青素含量，而且能促进木质素的合成，影响储藏根的形成，为储藏根发育的调控解析奠定基础。
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