摘要
O-乙酰丝氨酸（硫醇）裂解酶(O-acetylserine sulfhydrylase，OASS)是大肠杆菌硫酸盐同化途径及半胱氨酸合成中重要的生物酶之一，和丝氨酸乙酰转移酶(Serineacetyltransferase，SAT)以酶复合体的形式存在，通常被称为半胱氨酸合酶(Cysteinesynthase)。在微生物和植物细胞内，OASS和SAT将环境中的无机硫还原成-2价的硫，经二步酶催化途径由L-丝氨酸合成L-半胱氨酸。首先以丝氨酸和乙酰辅酶A为底物，在SAT催化下，合成O-乙酰丝氨酸(O-acetylserine，OAS)和辅酶A;然后在OASS的催化下，通过硫化物将OAS转化为半胱氨酸。通过替代第二步反应中底物，OASS能够利用各种亲核试剂合成出非蛋白质氨基酸。 非蛋白质氨基酸是自然界存在的蛋白质中发现的20种氨基酸以外的其他氨基酸，因其丰富了肽链的多样性，为跨越20种天然氨基酸屏障，人工合成蛋白质提供了基础材料，是国内外合成肽类、类肽类药物的主要成分，也是合成手性药物的极具吸引力的侯选基础材料，是众多新药的关键中间体，在科研和医药领域用途广泛。 本论文以大肠杆菌Escherichia coli(E.coli) DH5α基因组DNA为模板，PCR扩增得到大小为972bp的O-乙酰丝氨酸（硫醇）裂解酶A(OASS-A)基因cysK ORF区基因片段，将目的片段与表达载体pET-22b(+)相连，得到重组质粒CysK-pET-22b(+)，转化到表达菌中，筛选诱导表达条件，进行蛋白纯化，获得高浓度可溶的OASS-A重组蛋白。以O-乙酰丝氨酸(OAS)为底物，对得到的重组蛋白进行酶活性检测，测得纯化的重组蛋白的活性单位为750U/mg，酶的粗提液中重组蛋白的活性单位为400U/mg。以重组OASS-A作为酶催化剂，O-乙酰丝氨酸和苯硫酚作为底物，合成非蛋白质氨基酸S-苯基-L-半胱氨酸(S-phenyl-L-cysteine，S-P-C)，通过高效液相色谱和核磁共振技术对产物结构进行鉴定，得到高纯度的S-P-C。建立了通过得到大量的活性稳定的重组酶作为生物催化剂，高效率合成非蛋白质氨基酸的有效模式。根据药物拼接原理，将S-P-C与活性化合物积雪草酸、脱氧胆酸的有效基团进行偶联，对产物进行结构鉴定，并初步检测合成产物对癌细胞增殖影响初步检测，MTT实验结果显示，合成的终产物均具有一定的增殖抑制作用。
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