摘要
本研究分为三部分： 第一部分：整合素β1、α5β1、αv及FN在调控卵巢癌细胞失巢凋亡过程中的作用 背景：失巢凋亡(脱落凋亡，anoikis)是凋亡的一种形式，它是由于正常的上皮细胞或内皮细胞脱离与细胞外基质(extracellularmatrix，ECM)的联系而引起的。其生物学意义在于防止这些脱落的细胞种植于其他不适当的地方继续生长，是机体维持组织细胞稳定性的一种生理机制。大多数来源于上皮或内皮组织的肿瘤细胞，尤其是容易发生转移的恶性肿瘤细胞，则失去了这种特性，瘤细胞从瘤体上脱落后并不发生凋亡，因而可以种植到其他部位继续生长。这种存在于某些肿瘤细胞中的对失巢凋亡的敏感性降低被认为是肿瘤发生转移的一个重要机制。卵巢癌细胞易于早期脱落并在盆腹腔种植生长。逃避失巢凋亡可能是卵巢癌细胞在腹水中存活，并发生广泛腹腔转移的重要原因。对卵巢癌细胞耐受失巢凋亡的机理进行深入研究，将有利于理解其转移机制，发现一些潜在的治疗途径用于预防和控制卵巢癌的腹腔播散。 失巢凋亡/抗失巢凋亡现象的发生是一个多种调节因子参与的复杂过程。近年来，越来越多的研究者开始关注整合素(integrin)和失巢凋亡的关系。研究发现，整合素与其配体一各种ECM成分，如FN(fibronectin，纤粘连蛋白)、Ⅰ、Ⅳ型Ⅰ胶原蛋白等相互作用，可以抑制多种癌细胞，如胃癌、肺癌、前列腺癌anoikis的发生。但是，关于整合素及其配体介导的细胞信号在卵巢癌细胞逃避失巢凋亡过程中的作用，尚未见报道，我们认为该方面值得探讨。 目的：研究整合素β1、α5β1、αv及可溶性FN对卵巢癌细胞非贴壁生长能力的影响，及在此过程中p53、bcl-2、bax基因表达变化，caspase-3活性变化。探讨细胞表面整合素受体蛋白与FN的结合在肿瘤细胞逃避凋亡过程中的作用及其机制。 方法：间接免疫荧光染色检测人卵巢癌SKOV3细胞高转移亚克隆SKOV3-S1细胞中整合素蛋白β1、α5β1、αv的表达；用poly-hema阻止细胞贴壁，建立细胞悬浮分离培养导致凋亡的模型；AnnexinV/PI染色，流式细胞仪检测细胞凋亡：利用抗体封闭法检测不同整合素蛋白在凋亡过程中的作用；逆转录PCR法检测p53、bcl-2、bax在凋亡过程中基因表达的变化；比色法检测癌细胞内caspase-3活性改变。 结果： 1.SKOV3-S1细胞普遍表达β1、α5β1、αv整合素，表达率为分别为100％、98.2％、100％。 2.FN能保护SKOV3-S1细胞免于失巢凋亡，使凋亡率由63.7％降至29％，下降54.4％，其抑制作用可以被整合素受体蛋白αv的封闭抗体所阻止，β1单克隆抗体亦能部分阻止FN的凋亡抑制作用，而α5β1单克隆抗体对细胞凋亡没有影响。在无FN的情况下β1、α5β1、αv整合素抗体对细胞凋亡均没有影响。 3.在有FN作用时，SKOV3-S1细胞中凋亡调节基因bcl-2表达上升，bax表达下降，bcl-2/bax比率上升，p53基因表达无明显变化。αv封闭抗体能抑制FN对bcl-2及bax基因表达的调节作用。 4.在贴壁生长状态下，caspase-3几乎没有活性，而在悬浮生长状态下被激活，吸光度为0.284±0.033；FN使caspase-3活性减弱，吸光度为0.129±0.011；加入αv及β1封闭抗体后，酶活性增强，吸光度分别为0.238±0.024、0.203±0.010。 结论：SKOV3-S1细胞表面整合素受体蛋白αv通过与FN结合，提高了细胞凋亡调节基因bcl-2/bax的比率，使caspase-3活性减弱，这是SKOV3-S1细胞避免失巢凋亡的重要原因之一。 第二部分：整合素β1及FN在卵巢癌细胞粘附侵袭过程中的作用 背景：浸润性生长与远处转移是恶性肿瘤细胞重要的生物学特性之一。临床上大多数患者不是死于原发灶，而是死于不同程度的肿瘤转移。故肿瘤转移的研究是当前肿瘤研究的重要课题。卵巢恶性肿瘤的发病率在女性生殖道癌瘤中占第三位，但其死亡率却居第一位，其5年生存率也仅为30％左右，严重危害妇女的身心健康。上皮性卵巢癌具有肿瘤细胞脱落并种植于腹膜而导致广泛腹腔内转移的特性，加上卵巢位于盆腔深部，不易扪及或查得，使得约60％～70％的患者初诊时已出现腹腔转移。因此，研究卵巢癌的腹腔转移机制，明确与转移相关的因素，进而采取行之有效的阻断治疗措施，已成为提高疗效的关键，也是国内外卵巢癌研究的热点课题。 肿瘤侵袭转移是一个复杂的、多步骤的过程，在此过程中，肿瘤细胞的粘附、侵袭、运动都与肿瘤细胞与细胞外基质之间的相互作用以及由此介导的跨膜信号转导密切相关。整合素是一类介导细胞与细胞外基质粘附的细胞表面受体家族。近年来，整合素家族和肿瘤转移的关系已经成为一些学者的研究热点。β1整合素分布广泛，它与其配体FN间的相互作用不仅在支持、连接和维持组织形态方面起重要作用，而且具有调节细胞的粘附、生长、分化，促进细胞迁移、增殖以及信息传递等功能。已有研究证明，β1整合素能介导卵巢癌细胞粘附于腹膜。但其对卵巢癌细胞侵袭能力的影响和相关机制，尚待进一步深入研究。 目的：研究整合素β1及FN对卵巢癌细胞粘附侵袭能力的影响和作用机制。 方法：人工基底膜粘附实验和Boyden小室体外侵袭实验检测细胞的粘附和侵袭能力；利用抗体封闭法检测β1整合素蛋白对SKOV3-S1细胞粘附侵袭人工基底膜(matrigel)能力的影响。逆转录PCR法检测经整合素抗体处理及与FN结合后SKOV3-S1细胞基质金属蛋白酶(matrixmetalloproteinase，MMP)基因表达的变化。 结果： 1.β1整合素抗体能抑制SKOV3-S1细胞对matrigel的粘附，MTT法检测对照组的OD值为0.43±0.04，抗体抑制组为0.30±0.003，抑制率69.8％。 2.β1整合素抗体能明显抑制SKOV3-S1细胞对matrigel的侵袭穿透能力。12小时后对照组穿过的细胞数为48.4±8.8个，抗体处理组为16.6±5.5个，抑制率为65.7％。 3.FN能促进SKOV3-S1细胞迅速粘附、铺展，用β1整合素抗体处理后，细孢的粘附、铺展能力显著下降。 4.FN能诱导SKOV3-S1细胞表达MMP-2基因，β1整合素抗体能阻止这种诱导作用。 结论：β1整合素与纤粘连蛋白结合能诱导卵巢癌细胞粘附并表达MMP-2基因，从而促进肿瘤细胞的侵袭转移。 第三部分：FAK反义寡聚脱氧核苷酸对FN诱导卵巢癌细胞MMP-2表达的影响 背景：在肿瘤细胞的浸润和转移中，细胞外基质是一道天然屏障，肿瘤细胞的转移在于瘤细胞与屏蔽组织的粘附，并使之降解，最终瘤细胞穿越屏蔽组织向远处转移。近年来研究者对肿瘤细胞侵袭转移的分子机制进行了大量研究，逐渐意识到转移过程的一个关键就是肿瘤细胞与其生存的宿主组织基质建立平衡，使得后者可以促进肿瘤细胞的存活以及肿瘤克隆的形成。结缔组织的重建包括ECM成份的降解和重新合成两个过程。许多酶类参与ECM成份中大分子蛋白的降解。其中，基质金属蛋白酶的水解底物包括几乎所有的ECM成份，被认为是最重要的一类。明胶酶MMP-2作用的底物Ⅳ型胶原为ECM主要成分，故在肿瘤的浸润与转移中起重要作用。文献报道MMP-2及MMP-9在卵巢癌患者的组织、血浆、腹水中均有表达。研究发现，与FN的粘附可以诱导卵巢癌细胞MMP-2的表达，但卵巢癌细胞中MMP-2表达的确切机制，目前尚不明确。粘着斑激酶(focaladhesionkinase，FAK)是位于胞浆的催化酪氨酸磷酸化的蛋白酶，参与粘着斑(focaladhesionplaques，FAP)的形成，是细胞外基质-整合素信号通路中的关键酶，是体内多条信号转导途径的交汇点，参与多种生物学功能，与肿瘤细胞的侵袭转移和增殖密切相关。有关FAK在卵巢癌细胞MMP-2表达中的作用及意义文献中尚未见报道。 本实验通过体外细胞培养方式，观察细胞外基质成分FN对卵巢癌SKOV3-S1细胞MMP-2活性的影响，并尝试用反义寡核苷酸技术研究FAK在此过程中的作用，探寻FN诱导SKOV3-S1细胞MMP-2表达的机制。 目的：利用反义核酸技术探讨纤粘连蛋白诱导卵巢癌细胞中基质金属蛋白酶基因表达的机制。 方法：无血清培养人卵巢癌SKOV3细胞高转移亚克隆SKOV3-S1细胞，以FN诱导SKOV3-S1细胞中MMPs基因表达，用酶谱分析方法检测不同时间细胞培养上清中MMPs的活性。用反义寡聚脱氧核苷酸(AntisenseoligodeoxynucleotidesASODN)封闭粘着斑激酶，观察FAKASODN对MMPs活性的影响。 结果： 1.无FN包被时，SKOV3-S1细胞上清中无MMPs活性。 2.FN作用4小时时开始检测到MMP-2活性，作用8小时时活性最强，持续至24小时活性显著减弱。FN也能诱导MMP-9活性，但作用较弱。 3.FAK反义寡聚脱氧核苷酸作用于SKOV3-S1细胞后其MMP-2活性明显减弱。浓度为10-20μmol/l时作用最强。 结论：FN可诱导SKOV3-S1细胞粘附，进而引发一系列细胞内信号转导机制，启动MMP-2mRNA表达，影响MMP-2活性。这一作用可能经以FAK作为关键分子的Grb2/Ras/MAPKs信号转导途径完成的。
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