摘要
力生长因子(mechano growth factor，MGF)是力效应细胞在力刺激下，胰岛素样生长因子Ⅰ(insulin-like growth factor，IGF-Ⅰ)基因选择性剪接产生的由110个氨基酸组成的碱性多肽。MGF不仅是一种生长因子，也是一种修复因子。MGF在维持局部组织质量和修复组织的过程中起重要作用。 IGF-Ⅰ基因通过选择性剪切产生两种异构体: IGF-Ⅰ Ea和MGF。MGF的序列与成熟IGF-Ⅰ和IGF-Ⅰ Ea相比，除都拥有A，B，C和D结构域外，其主要差别是C端的E结构域。MGF比IGF-Ⅰ C端多一个含40个氨基酸的E结构域;MGF和IGF-ⅠEa的主要区别在于E结构域C端的24个氨基酸。研究发现MGF与成熟IGF-Ⅰ和IGF-ⅠEa的促细胞增殖和分化的功能不同，它的作用是促细胞增殖，但是抑制细胞分化，这一区别可能与它的C端E结构域有关。本研究拟通过基因工程手段对MGF和MGF的C端E结构域（又称E肽）进行体外表达纯化，并对它们的聚合性质和功能进行研究。研究内容包括以下三部分: 第一部分:MGF及其E肽的表达和纯化。分别构建pRSETc-MGF、pRSETc-MGFc40和pGEX-6P-1-MGFc24重组表达质粒。将重组质粒转化于E.coliBL21(DE3)中进行诱导表达。经Tris-Tricine SDS PAGE分析，融合蛋白His-MGF，His-MGFc40和GST-MGFc24均以可溶形式表达。表达产物分别通过His60 NiSuperflowTM Resin和Glutathione sepharose4B亲和层析纯化得到了纯的His-MGF,His-MGFc40和MGFc24蛋白。 第二部分: MGF自我聚合的特征研究。在上述实验中我们发现纯化的MGF及E肽易发生聚合现象，本部分实验利用体外pull down技术研究MGF与MGF, MGF的N端和MGF的C端E肽的相互作用。结果表明MGF能够和自身发生相互作用;MGF C端的E肽自身能发生相互作用;MGF的N端能与MGF C端24个氨基酸多肽发生相互作用;MGF的N端之间没有相互作用。因此，MGF的聚合很可能通过其C端E肽之间以及C端E肽与N端之间的相互作用进行。 第三部分: MGF及其E肽对C2C12成肌细胞的作用研究。本部分实验用纯化得到的His-MGF，His-MGFc40和MGFc24作用小鼠C2C12成肌细胞，分别用CCK-8法和肌酸激酶(Creatine kinase，CK)法检测它们对小鼠成肌细胞C2C12增殖和分化的作用;然后通过检测它们作用后细胞内游离钙离子浓度及胞外信号调节激酶(ERK1/2)的激活作用。结果表明His-MGF，His-MGFc40和MGFc24具有促进C2C12细胞增殖和抑制其分化的活性。His-MGF，His-MGFc40和MGFc24作用于C2C12细胞能够提高细胞内游离钙离子的浓度。His-MGF和His-MGFc40具有激活胞外信号调节激酶(ERK1/2)的作用。因此，MGF及其E肽对于C2C12细胞的作用可能是通过激活细胞内的钙信号及ERK信号通路来实现的。
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