摘要
乳酸菌在自然界中分布广泛，与人类关系极为密切，除少数病原菌外，大部分乳酸菌为促进人体健康的益生菌，在食品和医药领域中都具有重要的应用价值。因此乳酸菌发酵食品具有强大的生命力和广阔的应用前景，已逐渐成为当今世界食品业发展的必然趋势。随着分子生物学技术和基因工程的迅猛发展，近年来对乳酸菌的研究已不再满足于传统生理功能的开发，而是对其进行遗传修饰并赋予新的生物活性。目前，乳酸菌作为重组载体受体菌株的研究已卓见成效，人们利用DNA重组技术，使其携带外源基因并表达外源基因产物，从而使乳酸菌具备新的有益性能。但由于乳酸菌为革兰氏阳性菌，细胞壁厚而致密，对DNA分子进入细胞有明显的阻碍作用，这导致外源DNA导入乳酸菌的效率极低，严重制约着乳酸菌的遗传操作和分子机制的研究。因此，提高乳酸菌的遗传转化效率是目前亟待解决的关键技术问题。本文用典型的大肠杆菌-乳酸菌穿梭质粒pMG36e作为载体，以保加利亚乳杆菌MH、鼠李糖乳杆菌05-28和于酪乳杆菌05-20作为受体菌株，通过制备原生质体进行电转化的方法研究了实现转化所需的条件:受体菌株的适宜菌龄与细胞前处理方法、缓冲液、溶菌酶浓度、质粒浓度、电转化参数以及再生培养基组成对电转化效率的影响。确定了保加利亚乳杆菌MH、鼠李糖乳杆菌05-28以及干酪乳杆菌05-20的最适电转化条件并显著提高了电转化效率。同时，构建了适用于保加利亚乳杆菌MH、鼠李糖乳杆菌05-28以及干酪乳杆菌05-20的通用电转化条件。 研究结果表明，将在MRS中培养至对数中期(8h)的保加利亚乳杆菌MH以1％接种量转接至含2％甘氨酸的SMRS培养基继续培养至对数中期(8h)，收获细胞用SMM缓冲液洗涤菌细胞并用SMM配制成浓度为30mg/mL的溶菌酶酶液，于37℃酶解至镜检时视野内出现60％左右原生质体，加入1μL浓度为1μg/μL的质粒pMG36e，在电场强度7.5kV/cm，电阻200Ω，电容25μF的条件下进行电击转化，以含有0.5mol/L蔗糖和20mmol/L的MgCl2、CaCl2且无吐温80的MRS再生培养基复苏培养2h，并用亚抑制抗生素浓度筛选转化子获得了较高的电转化率，达到1.43×105cfu/μgDNA。同时，将在MRS中培养至对数中期(9h)的鼠李糖乳杆菌05-28以1％接种量转接至含2％甘氨酸的SMRS培养基继续培养至对数中期(8h)，收获细胞以SMM缓冲液洗涤菌细胞并用SMM配制成浓度为30mg/mL的溶菌酶酶液，于37℃酶解至镜检时视野内出现60％左右原生质体，加入1μL浓度为1μg/μL的质粒pMG36e，在电场强度8kV/cm，电阻200Ω，电容25μF的条件下进行电击转化，以含有0.5mol/L蔗糖和20mmol/L的MgCl2、 CaCl2且无吐温80的MRS再生培养基复苏培养2h，并用亚抑制抗生素浓度选择转化子获得了较高的电转化率，达到1.66×105cfu/μgDNA。而对于干酪乳杆菌05-20，将在MRS中培养至对数中期(4h)的菌种以1％接种量转接至含0.5％甘氨酸的SMRS培养基继续培养至对数中期(4h)，收获细胞以SMM缓冲液洗涤菌细胞并用SMM配置成浓度为20mg/mL的溶菌酶酶液，于30℃酶解至镜检时视野内出现60％左右原生质体，加入1μL浓度为1μg/μL的质粒pMG36e，在电场强度9kV/cm，电阻200Ω，电容25μF的条件下进行电击转化，以含有0.5mol/L蔗糖和20mmol/L的MgCl2、CaCl2且无吐温80的MRS再生培养基复苏培养2h，并用亚抑制抗生素浓度选择转化子获得了较高的电转化率，达到1.28×105cfu/μgDNA。 本实验结果为外源质粒pMG36e电转化保加利亚乳杆菌MH、鼠李糖乳杆菌05-28以及干酪乳杆菌05-20提供了可行的参考依据，为乳杆菌遗传育种、菌种改良以及迸一步构建乳杆菌组成型高效表达体系奠定了基础。
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