摘要
肝脏枯否氏细胞是一种非常重要的先天免疫细胞，执行着重要的先天免疫功能，是抵抗消化系统病原微生物入侵的第一道屏障。枯否氏细胞是肝脏中固有的土著巨噬细胞，参与炎症与免疫反应，具有清道夫和调节肝脏再生的功能。枯否氏细胞对肝脏的正常生理功能和枯否氏细胞蛋白质组表达谱的研究不仅是肝脏蛋白质组表达谱的重要组成部分，也是通过组学的方法研究枯否氏细胞功能的重要基础。已有研究对枯否氏细胞蛋白和功能了解缺乏，而通过高通量鉴定的方法能获得大规模的蛋白信息，可以更全面了解细胞功能，对肝脏枯否氏细胞蛋白质表达谱的构建将有利于我们更好的从整体水平认识肝脏枯否氏细胞的功能，同时也将为我们大规模的发现新的细胞蛋白、细胞功能及其作用机制奠定基础。 本研究中，我们以小鼠为模型通过原位灌流消化和密度梯度离心初步分离获得非实质细胞，然后利用细胞免疫磁珠法识别枯否氏细胞表面的标志物F4/80并对肝脏枯否氏细胞进行分离与纯化。流式细胞术检测发现，分离的细胞中F4/80标记阳性细胞占98％左右，说明获得了高纯度的枯否氏细胞。细胞形态观察和吞噬功能实验进一步表明本研究分离到的细胞呈枯否氏细胞样形态，同时具有明显的吞噬功能。 枯否氏本研究中我们采用SDS-PAGE和LC/MS/MS的方法对枯否氏细胞的表达谱进行了构建，鉴定到可信蛋白4313个，并通过对蛋白非标定量，获得了其中3389个蛋白的相对定量信息。通过功能注释结果发现大量参与肝脏生理和免疫功能的蛋白质群，其中包括参与代谢反应的蛋白1357个，参与免疫反应的蛋白69个，与吞噬功能相关的蛋白51个，参与炎症反应的蛋白32个。尽管与肝脏组织其它类型细胞的蛋白质组进行比较发现，枯否氏细胞与肝脏其他类型细胞参与的代谢通路相似，但也有623个蛋白只在枯否氏细胞中鉴定到，其中包括（某某）膜蛋白49个，这些可能是枯否氏细胞特异于肝脏其他细胞的潜在标志性分子。 另外，我们对本研究获得的枯否氏细胞与文献已经报道的枯否氏/巨噬细胞数据集（4291个蛋白）进行了比较，结果表明两者间共有的蛋白1980个，本研究新鉴定到的蛋白2433个。在这些新鉴定到的蛋白中含生化酶类蛋白475个，激酶类蛋白100个，受体类蛋白80个，蛋白酶类蛋白71个，转录因子类蛋白47个，磷酸酶类蛋白36个，吞噬功能类蛋白24个，免疫相关蛋白21个，配体类蛋白14个和炎症相关蛋白11个。通过与文献巨噬细胞蛋白质数据比较，我们发现了多条枯否氏细胞全覆盖的代谢通路和多条只有枯否氏细胞覆盖到的信号通路。 在研究结果中，部分信号通路首次从枯否氏细胞中枯否氏鉴定，如SLIT/ROBO信号通路。所以，我们选择性的对ROBO4在枯否氏细胞中的功能进行了进一步的研究。反转录PCR和western-Blot结果进一步证明了ROBO4在枯否氏细胞和Raw264.7细胞中的表达。同时，我们研究了LPS刺激对ROBO4在RAW264.7细胞中表达的影响，结果表明，LPS刺激RAW264.7细胞后，炎症相关因子IL-β、TNF-α和IL-6上调而ROBO4的表达下调，说明ROBO4的表达与LPS的刺激相关，ROBO4可能与炎症反应的调控相关。 总之，通过本项研究，我们建立了小鼠肝脏原代枯否氏细胞分离纯化的方法及其纯度的评价体系;并构建了高精度、高可信的枯否氏细胞蛋白质表达谱数据枯否氏;通过和已有文献及数据比较获得了枯否氏细胞的特异性蛋白623个;发现了一批在枯否氏/巨噬细胞细胞中表达的新蛋白，新代谢通路和信号通路。这是第一次对枯否氏氏细胞蛋白质组的较为全面的了解，对这些数据的深入发掘可以为研究肝脏枯否氏细胞功能与作用提供线索和依据，枯否氏
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