摘要
有机磷类杀虫剂(organophosphorus insecticides，OPI)包括久效磷、高灭磷已被证实能够干扰哺乳动物下丘脑-垂体-肾上腺轴(hypothalamic-pituitary-adrenal axis，HPA轴)功能，影响血浆皮质醇/皮质酮水平并引起高血糖症。HPA轴是三大内分泌轴线之一，其主要功能是调节动物的适应性应激反应，HPA轴受到干扰可能会直接影响动物的应激反应能力。然而，有关OPI对脊椎动物尤其是鱼类应激功能影响的研究比较少见。目前已知大多脊椎动物的应激应答都具有雌雄特异性即性二态性，因此，本文采用有机磷农药——久效磷分别暴露雌雄斑马鱼，暴露结束后给予二次胁迫（空气暴露），以应激激素皮质醇（肾间应激轴的终端激素）为指标检测久效磷农药是否能够影响斑马鱼的应激功能并干扰其二次应激，雌雄斑马鱼在空气暴露胁迫下的皮质醇应激应答是否具有性二态性;其次在下丘脑、垂体、肾间腺各个水平上检测下丘脑-垂体-肾间腺轴(hypothalamic-pituitary-interrenal axis，HPI轴)相关调控因子的基因表达水平，探讨久效磷农药干扰斑马鱼皮质醇应激应答的作用机制;最后在肝脏（皮质醇作用的下游靶组织之一）水平上，进一步探究久效磷农药是否影响肝脏组织对皮质醇的应答性。 本文研究结果表明: (1)1μg/l、10μg/l和100μg/l久效磷农药暴露雌雄斑马鱼21d后，给予二次急性胁迫（空气暴露处理），采用同位素放射免疫分析法(radioimmunoassay, RIA)检测了斑马鱼整体皮质醇含量，结果表明:雌性斑马鱼整体皮质醇含量随暴露浓度的增加呈逐渐下降的趋势，其中100μg/l久效磷农药暴露雌鱼组的整体皮质醇含量显著降低，而久效磷农药暴露对雄性斑马鱼整体皮质醇水平均没有显著性影响。因此，我们认为100μg/l久效磷农药亚慢性暴露能够显著抑制雌性斑马鱼的皮质醇应答，雌性斑马鱼对久效磷农药的暴露可能更加敏感。此外，在空气暴露胁迫下，对照组雌雄斑马鱼皮质醇水平均无差异，表明雌雄斑马鱼的皮质醇应激应答无性二态性。 (2)1μg/l、10μg/l和100μg/l久效磷农药分别暴露雌雄斑马鱼21d后，给予二次急性胁迫（空气暴露处理），采用了实时定量PCR(real-time PCR)检测了雌雄斑马鱼下丘脑促肾上腺激素释放因子(CRF)、糖皮质激素受体(GR) mRNA表达水平，垂体促肾上腺激素前体(POMC)mRNA水平，肾间腺皮质醇合成相关因子黑皮素2型受体(MC2R)、类固醇激素合成急性调节蛋白(StAR)和11β-羟化酶(P45011β)，以及皮质醇代谢相关酶11β-羟类固醇脱氢酶(11β-HSD2)和20β-羟类固醇脱氢酶(20β-HSD2)的mRNA表达水平。结果发现:100μg/l久效磷农药暴露雌鱼组垂体POMC、肾间腺MC2R mRNA水平显著降低，皮质醇的合成可能受到抑制;雌鱼肾间腺20β-HSD2 mRNA表达水平极显著升高，从而进一步促进了皮质醇的代谢;下丘脑GR mRNA水平极显著降低，皮质醇负反馈途径受到干扰;本研究表明久效磷农药可能在下丘脑-垂体-肾间腺轴多水平上发挥了干扰效应，最终导致雌性斑马鱼整体皮质醇水平降低，应激能力减弱。100μg/l久效磷农药暴露虽然导致雄鱼肾间腺StAR、P45011β mRNA表达水平显著降低、20β-HSD2mRNA表达水平显著升高，但是其整体皮质醇含量没有显著性变化。推测原因可能有1.肾间腺皮质醇的合成与代谢可能不是影响整体皮质醇水平的决定性因素;2.雄鱼的大脑GR mRNA水平并没有发生变化，说明负反馈途径并未受到影响，负反馈途径对皮质醇水平的调节可能更为关键。 (3)1μg/l、10μg/l和100μg/l久效磷农药分别暴露雌雄斑马鱼21d后，给予二次急性胁迫（空气暴露处理），采用了实时定量PCR(real-time PCR)检测了雌雄斑马鱼肝脏糖皮质激素受体(GR)、酪氨酸转氨酶(TAT)和磷酸烯醇式丙酮酸羧基酶(PEPCK) mRNA表达水平。结果发现:100μg/l久效磷农药暴露导致雌雄鱼GR mRNA表达水平较对照组显著降低，TAT和PEPCK mRNA表达水平均没有显著性变化，表明高浓度久效磷农药暴露可能导致雌雄斑马鱼肝脏组织对皮质醇的响应能力降低。 综上所述，本研究表明高浓度久效磷农药暴露能够显著降低雌性斑马鱼的整体皮质醇水平，从而减弱雌鱼对二次胁迫的应激能力。久效磷农药可能从垂体POMC调控，肾间腺皮质醇激素的合成与代谢以及大脑负反馈途径等HPI轴的多个层面发挥干扰效应，最终导致雌鱼的整体皮质醇含量降低。此外，久效磷农药暴露还可能导致下游靶组织对皮质醇的应答能力降低。总之，本文从下丘脑-垂体-肾间腺轴的角度，较系统的阐明了久效磷农药干扰斑马鱼应激能力的潜在作用机制，以期为有机磷农药对鱼类应激功能的生态风险评价提供一定的借鉴。
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