摘要
近年来，关于生物活性多糖的研究已被越来越多的学者所关注，其中关于多糖的分子修饰以及生物活性研究已经成为目前国内外研究的热点。我们课题组分离纯化得到一株锦鸡儿根瘤菌(Rhizobium sp.N613)，在其液态发酵液中可以提取出丰富的胞外多糖(REPS)。本论文着重进行了小分子REPS(LREPS)的制备、理化性质测定以及其生物活性的初步研究，以期为拓展REPS的应用奠定基础。 在LREPS的制备及其条件优化研究中，选用微波辐照氧化降解和60Co辐照降解两种方法对REPS进行降解，以平均分子量为检测指标。在微波辐照氧化降解中，选用正交法对降解条件进行优化研究。结果表明，影响REPS降解的因素顺序分别是H2O2浓度最强，辐照强度次之，REPS用量再次之，辐照时间的影响最小;其中H2O2浓度对降解的影响较显著，微波辐照强度对降解的影响显著。微波辐照氧化降解REPS的最佳组合为REPS浓度为3 mg/mL，H2O2浓度为4％，微波辐照强度为375W，辐照时间为3min;在该条件下进行验证实验，所得LREPS的平均分子量为11.649 KD。在60Co辐照降解中，分别选择12 h和24 h进行降解。研究结果显示，LREPS的平均分子量随着辐照时间的延长而降低，且降解12 h的LREPS的平均分子量为11.082 KD左右，降解24h的LREPS平均分子量为7.369 KD左右。 在LREPS体内抗肿瘤活性的研究中，选用动物移植性实体瘤的抑瘤率及免疫脏器指数为检测指标，研究了腹腔注射不同分子量的LREPS对小鼠肉瘤S180的体内抗肿瘤活性的影响。结果表明，各分子量LREPS对小鼠肉瘤S180均有不同程度的抑制作用，且随着多糖分子量的降低，其活性逐渐增强，当其平均分子量降到11.082KD左右时活性最高，抑瘤率达到51.63％，分子量再降低为7.369KD时，抗肿瘤活性降低。与阴性对照组相比，各实验组小鼠的脾和胸腺指数均显著增加，而环磷酰胺组小鼠的脾和胸腺则出现严重萎缩，说明各多糖不仅能够有效抑制肿瘤生长，而且对小鼠的免疫器官有一定的保护作用。 我们对该分子量为11.082 KD左右的LREPS进行了红外图谱的结构分析，并测定其理化性质，包括溶解度以及特性粘数。研究结果显示，该LREPS的醇羟基的相对含量增加，出现了-CH2-伸缩振动，1730cm-1处出现羧基吸收峰，在1300 cm-1～1050cm-1之间出现强吸收峰且呈现2条谱带，表明存在酯基，上述数据表明多糖部分支链被成功裂解。虽然裂解的具体位置并不确定，但是由于指纹区结构基本没变，仍为β-D-葡萄吡喃糖。通过对LREPS的理化性质的测定，结果显示，LREPS的溶解度由原来的8 g/L提高到15.56 g/L，特性粘数由原来的527.64 mL/g降低至348.31mL/g。 在REPS和LREPS抗氧化活性的研究中，通过测定还原力、羟自由基和超氧阴离子的清除能力以及对有H2O2引起的氧化溶血现象和小鼠肝组织自发性脂质过氧化的抑制作用的研究，结果表明，REPS在降解前后均有显著的体外抗氧化活性，但LREPS的抗氧化活性比REPS要高。这可能是由于裂解后的LREPS的溶解度增加、粘度降低，可能有利于多糖分子与活性位点结合。此外，抗氧化活性与多糖浓度之间呈现一定的量效关系，即抗氧化活性随多糖浓度增加而增强，这充分说明了该多糖具有良好的抗氧化功能。 上述试验结果表明，REPS经过降解后所得LREPS的溶解度增加，特性粘数降低，抗肿瘤活性和抗氧化活性均有一定程度的增强，为拓展REPS在医药领域的应用奠定了基础。
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