金荞麦提取物对肥大细胞介导的腹泻型肠易激综合征的作用及其机制初探

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中文摘要：[研究目的与意义] 目前诸多研究表明肥大细胞(MC)及其释放的相关介质是导致腹泻型肠易激综合征(D-IBS)发病的关键环节，因此针对MC的治疗是中西医研究的热点与难点。本课题拟:(1)从体内实验验证金荞麦提取物(Fag)对D-IBS模型大鼠胃肠道动力紊乱、内脏高敏感性、肠黏膜低度炎症、肠黏膜屏障受损及MC活化脱颗粒的影响;(2)从体外实验探讨Fag治疗抗原诱导的MC活化脱颗粒的分子机制。从而拓宽了金荞麦的临床适应症范围，为开发具有自主知识产权的新药物奠定实验基础，具有可观的临床应用价值和市场前景。 [研究方法] 1、体内实验 (1)予新生期母婴分离联合乙酸灌肠、鸡卵清白蛋白腹腔注射建立D-IBS大鼠模型，通过统计D-IBS模型大鼠排便颗粒数、观察粪便Bristol分级、腹壁回撤反应(AWR)、肠黏膜HE染色等方法评价模型的可靠性。(2)观察Fag对D-IBS模型大鼠排便颗粒数、粪便Bristol分级、AWR、肠黏膜HE染色的影响。予免疫组化检测D-IBS模型大鼠肠黏膜MC数目及活化脱颗粒程度;予免疫组化、ELISA法检测远端结肠黏膜类胰蛋白酶(tryptase)水平;予免疫组化、Western blot检测远端结肠蛋白酶激活受体2(PAR-2)表达;予ELISA法检测远端结肠黏膜TNF-α、IL-6的表达;予免疫组化、ELISA法检测远端结肠黏膜P物质(SP)表达;予Western blot检测远端结肠occludin蛋白表达;观察Fag对上述指标的作用。 2、体外实验通过抗原诱导大鼠嗜碱性白血病细胞(RBL-2H3)建立MC活化脱颗粒模型。予MTS法检测Fag对RBL-2H3细胞的增殖活性，筛选Fag的安全工作浓度;予底物显色反应检测RBL-2H3细胞上清β-Hex释放;予ELISA检测细胞上清tryptase、TNF-α、IL-6水平;予Weaternblot检测抗原诱导的RBL-2H3活化脱颗粒相关受体及蛋白FcεRI、p-Lyn、Lyn、p-Syk、Syk、MAPK家族(p-ERK1/2、p-JNK、p-p38、ERK1/2、JNK、p38)、p-AKT、AKT、p-Plcγ1/2、p-PKCβ的表达，观察Fag对上述指标的作用。 [结果] 1、体内实验 (1)模型改良及评价:采用新生期母婴分离、乙酸灌肠、鸡卵清白蛋白腹腔注射三法复制的模型，大鼠表现出皮毛色泽变暗、活动度减少、喜好扎堆等表现;排便颗粒数增加、粪便Bristol分级升高、20、40、60mmHg球囊压力下AWR评分增高、肠黏膜HE染色存在少量炎性细胞浸润。该复合造模方法可基本复制D-IBS模型。 (2) Fag对D-IBS模型大鼠整体疗效评价:①Fag各剂量组对大鼠体重增长率无明显影响，与酮替芬组疗效相当。②Fag中、高剂量组可有效减少排便颗粒数，高剂量组与酮替芬组疗效相当。③Fag中、高剂量组可有效降低粪便Bristol分级，与酮替芬组均疗效相当。④20mmHg球囊压力下，Fag中、高剂量组、酮替芬组可有效降低AWR评分，高剂量组与酮替芬组疗效相当;40mmHg球囊压力下，Fag中、高剂量组、酮替芬组可有效降低AWR评分，且高剂量组疗效优于酮替芬组;60mmHg球囊压力下，Fag高剂量组、酮替芬组可有效降低AWR评分，两组疗效相当;80 mmHg球囊压力下，Fag各剂量组、酮替芬组对AWR评分无影响。⑤Fag中、高剂量组、酮替芬组均可降低肠黏膜低度炎症。 (3) Fag对D-IBS模型大鼠MC及其相关物质的作用:①Fag高剂量组、酮替芬组可减少MC数目，高剂量组与酮替芬组疗效相当;Fag中、高剂量组、酮替芬组可抑制MC活化脱颗粒，高剂量与酮替芬组疗效相当。②Fag中、高剂量组、酮替芬组可降低远端结肠黏膜tryptase表达，高剂量组与酮替芬组疗效相当。③Fag中、高剂量组、酮替芬组可显著降低远端结肠黏膜TNF-α、IL-6水平，Fag高剂量组与酮替芬组疗效相当。④Fag中、高剂量组、酮替芬组可显著降低远端结肠黏膜上皮PAR-2蛋白表达，高剂量组与酮替芬组疗效相当。⑤Fag中、高剂量组、酮替芬组可显著降低远端结肠SP表达，且Fag高剂量疗效优于酮替芬组。⑥Fag中、高剂量组、酮替芬组可显著提高远端结肠occludin蛋白表达。 2、体外实验 (1) Fag在3-50μg/ml浓度范围内对细胞增殖活性无抑制作用，选择10、30、50μg/ml浓度范围作为Fag的安全工作浓度。 (2) Fag中、高剂量对抗原诱导的RBL-2H3细胞β-HEX释放率具有抑制作用。 (3) Fag中、高剂量组可抑制RBL-2H3细胞tryptase释放。 (4) Fag中、高剂量组可抑制RBL-2H3细胞TNF-α、IL-6释放。 (5)各浓度Fag对上游蛋白FcεRI、p-Lyn、Lyn、p-Syk、Syk无明显作用。 (6) Fag可抑制p-JNK、p-p38、p-ERK1/2表达，但具有选择性，其中Fag中、高剂量组对p-JNK、p-ERK1/2蛋白的作用明显，Fag高剂量组对p-p38蛋白作用明显，各浓度Fag对JNK、p38、ERK1/2表达均无明显作用。 (7)各浓度Fag对p-AKT、AKT蛋白均无明显作用。 (8)各浓度Fag对p-Plcγ1/2蛋白均无明显作用，Fag中、高剂量可抑制p-PKCβ蛋白表达。结论: 1、体内实验 (1)新生期母婴分离联合乙酸灌肠、鸡卵清白蛋白腹腔注射可模拟D-IBS胃肠道动力增高、肠黏膜屏障受损、内脏高敏感、肠黏膜低度炎症等特征。 (2) Fag可剂量依赖性地降低D-IBS模型大鼠降低内脏高敏感，减轻肠黏膜低度炎症，缓解胃肠动力亢进、改善肠黏膜屏障受损的机制与抑制D-IBS模型大鼠肠黏膜MC数量及活化脱颗粒，降低促炎细胞因子TNF-α、IL-6及类胰蛋白酶释放，下调PAR-2受体，减少SP释放，上调occludin蛋白有关。与酮替芬相比，Fag降低内脏痛觉（40mmHg球囊压力下）的疗效优于酮替芬，其余各项指标两者疗效相当。 2、细胞实验 Fag可剂量依赖性抑制抗原诱导的RBL-2H3细胞活化脱颗粒，减少tryptase、TNF-α、IL-6释放，其分子机制与抑制下游信号MAPK家族蛋白(ERK1/2、JNK、p38)及PKCβ蛋白的磷酸化有关。

作者：

严晶

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关键词：

金荞麦提取物腹泻型肠易激综合征肥大细胞体外实验动物模型

授予学位：

博士

学科专业：

中西医结合临床

导师：

孙志广

学位年度：

2014

学位授予单位：

南京中医药大学

语种：

中文

中图分类号：