摘要
本论文对鸭疫里默氏杆菌(Riemerella anatipestifer，RA)外膜外排基因做了以下的一些研究:RA(outer membrane effiux protein，OEP)外膜外排蛋白基因核苷酸生物学特性分析、该基因编码的蛋白生物学特性分析、外膜外排基因的T克隆及亚克隆、原核表达、重组蛋白的纯化、兔抗RA外膜外排基因多克隆抗体的制备、多克隆抗体的粗提、用实时荧光定量PCR的方法来检测RA外膜外排蛋白基因表达量与RA耐四环素的关系。结果如下: 1.RA外膜外排蛋白基因生物信息学分析 该基因有一个完整的ORF，其基因片段长度为1437bp，NCBI BLASTN进行序列比对发现该基因与GenBank上提交的RA CH-2和RA ATCC11845的外膜外排蛋白基因序列相似度最高，对RA OEP基因密码子偏嗜性分析显示该基因密码子的偏性比较弱并且没有2个以上的稀有密码子串。系统进化树分析该蛋白质与RA CH-2和RAATCC11845外膜外排蛋白的亲缘关系最近，并且还属于同一分支，有信号肽，但没跨膜区，抗原表位相对集中，有4种不同的功能位点，即分别为蛋白激酶C磷酸化位点、N-豆蔻酰化位点、酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点及N-糖基化位点。二级结构预测显示α螺旋占主要部分，该基因编码蛋白定位在外膜上。 2.RA外膜外排蛋白基因T克隆、原核表达及多克隆抗体制备 依据外膜外排蛋白基因序列设计一对合适的引物，用于PCR的扩增，其扩增出的基因片段长度为1437bp。构建重组原核表达质粒pET-32a(+)/OEP，并将其转化到大肠杆菌BL21中，用IPTG使其诱导表达，表达出一个约为64KD的融合蛋白。纯化重组蛋白，并对新西兰大白兔进行免疫，制备出多克隆抗体，即兔抗RA OEP血清，制备的血清琼扩效价为1∶16，Western-Blot显示兔抗RA血清能与纯化的重组蛋白发生特异性反应。 3.RA外膜外排蛋白基因表达量与不同浓度四环素的关系 RA耐四环素MIC值的测定采用的是二倍稀释法的方法，其MIC值为20μg/mL。将RA在10μg/mL的范围内进行梯度培养，提取各自的RNA，并进行反转录，用实时荧光染料定量PCR的方法对OEP基因表达量与RA耐四环素的关系进行分析，结果发现，当四环素浓度在9μg/mL范围内，OEP基因的表达量随着所培养的RA中四环素浓度的变化而呈现先上升后下降的趋势。
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