摘要
本论文以鲜猪骨为原料，通过木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和Alcalase碱性蛋白酶等三种酶制备猪骨蛋白酶解产物，以小鼠脾淋巴细胞的增殖率为主要指标，参考水解度，根据单因素和正交试验优化酶解条件;对在最佳酶解条件下得到的猪骨蛋白酶解产物，通过超滤、凝胶过滤层析以及离子交换层析等分离纯化技术进行分离纯化以制备出免疫活性肽。主要研究结果如下: 木瓜蛋白酶的水解最佳条件为:时间4h、pH值5.5、酶底比7000 U/g、温度55℃、底物浓度6％，此时脾细胞增殖率为79.50％，水解度为18.25％;胰蛋白酶的水解最佳条件为:时间5h、pH值7.5、酶底比5000 U/g、温度50℃、底物浓度6％，此时脾细胞增殖率为67.14％，水解度为21.25％; Alcalase碱性蛋白酶的水解最佳条件为:时间4h、pH值9.5、酶底比6000 U/g、温度45℃、底物浓度6％，此时脾细胞增殖率为98.41％，水解度为16.82％。Alcalase碱性蛋白酶酶解后的产物脾细胞增殖率最高。 猪骨蛋白酶解液采用截流分子量分别为2Ku、3Ku、5Ku、10Ku的超滤离心管进行分离，分离后得到的分子量分别为＞10Ku、5Ku～10Ku、3Ku～5Ku、2Ku～3 Ku和＜2Ku的5个肽段的组分，其中，分子量＜2Ku的肽段组分的脾细胞增殖率最高，其增殖率为100.89％。对超滤离心后分子量＜2Ku的肽段组分首先采用凝胶过滤层析接着再进行离子交换层析分离，其分离结果显示:猪骨蛋白酶解液通过凝胶过滤层析之后被分为4个分离峰（即4个组分），其中第2组分对小鼠脾淋巴细胞的增殖率最高，且剂量关系最明显，当浓度在100μg/mL时，脾淋巴细胞的增殖率为109.83％。第2组分经离子交换层析后被分成了9个峰（即9个组分），其中第4组分增殖活性最强，且剂量关系最明显，当浓度在100μg/mL时，脾淋巴细胞的增殖率为114.30％。对超滤后分子量＜2Ku的肽段组分首先使用离子交换层析接着再进行凝胶过滤层析分离，其分离结果显示:猪骨蛋白酶解产物通过离子交换层析后被分成了8个峰（即8个组分），其中第5组分增殖活性最强，且剂量关系最明显，当浓度在100μg/mL时，脾淋巴细胞的增殖率为107.97％。第5组分经凝胶过滤层析后被分为5个峰（即5个组分），其中第3组分增殖活性最强，且剂量关系最明显，当浓度在100μg/mL时，脾淋巴细胞的增殖率为110.95％。 通过比较两种分离纯化方法对猪骨蛋白酶解液的分离效果，可以确定最佳的分离纯化方法为:猪骨蛋白的酶解产物首先进行超滤分离，然后再进行凝胶过滤层析分离，最后进行离子交换层析分离。分离得到的免疫活性肽对小鼠脾细胞增殖率为114.30％。
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