摘要
知母为百合科植物知母（Anemarrhena asphodeloides Bge.）的干燥根茎，主要含有甾体皂苷类成分。文献及预实验研究表明，知母皂苷AⅢ(Timosaponin AⅢ，TAⅢ)具有较强的药理学活性。然而，药材中知母皂苷BⅡ含量较高，《中国药典》2010版规定不少于3.0％，文献报道最高达10.25％; TAⅢ含量较少，仅为知母皂苷BⅡ(Timosaponin BⅡ，TBⅡ)的1/20。采用传统的酸水解的方法难以将TBⅡ水解为TAⅢ。 本课题采用酶解法将TBⅡ转化为TAⅢ，并进行TAⅢ的体外抗肿瘤活性、自微乳释药系统及体内药动学研究。 首先研究知母药材中TBⅡ的醇提工艺及大孔树脂纯化工艺。以TBⅡ提取率为考察指标，采用L9(34)正交试验，优化TBⅡ回流提取工艺;并考察8种大孔树脂对TBⅡ的吸附和解析性能，优选树脂品种，确定最佳纯化工艺条件。正交试验表明，TBⅡ的最佳提取工艺为:50％乙醇加热回流提取2次，每次2h，先加入2.5倍体积的溶剂浸泡，再分别加入6倍50％乙醇提取。通过对树脂的考察，优选出对TBⅡ吸附率和解析率都很高的HPD100树脂，上样浓度为0.23g/mL，最大上样量为4/5BV，以3BV水和6BV的20％乙醇洗脱杂质后，用5BV的50％乙醇洗脱得到纯度为50％左右的TBⅡ。 建立TAⅢ的HPLC含量测定方法，优化确定TAⅢ的制备工艺。采用β-葡萄糖苷酶水解TBⅡ制备TAⅢ，以转化率为指标，通过单因素考察反应温度、反应时间、pH值及酶用量对转化率的影响，采用L16(45)正交试验优化制备工艺。结果，酶解反应的最适条件为55℃、pH5.0醋酸-醋酸钠缓冲液、酶用量为600U/g、反应时间3h。对酶解产物采用硅胶柱分离纯化，得到纯度大于90％的TAⅢ，得率为47％左右。 采用MTT法比较TBⅡ、TAⅢ、菝葜皂苷元(Sarsasapogenin，SAR)三者的抗肿瘤活性，结果表明，TAⅢ对Hela肿瘤细胞及胰腺癌肿瘤细胞PANC-1有较强的抑制作用，浓度为30μg/mL时，抑制率达97％。TAⅢ抗胰腺癌肿瘤细胞PANC-1的活性远高于SAR，而TBⅡ无此活性。TAⅢ对胰腺癌PANC-1的1C50值为13.37μmol/L。本文进一步探讨TAⅢ对胰腺癌细胞PANC-1凋亡的相关机制。实验结果提示，TAⅢ主要通过抑制凋亡调节因子Bcl-2的转录，促进Juk-p53-Bax通路的活化诱导PANC-1细胞的凋亡。 对TAⅢ进行了处方前稳定性研究，考察其在高温(40℃、60℃)、高湿（相对湿度92.5％±5％）、强光（4500 Lx±500 Lx）下的稳定性。结果表明，TAⅢ不受高温、高湿、强光环境的影响，性质稳定。 建立了制剂中TAⅢ的HPLC含量测定方法，研究了空白自微乳和载药TAⅢ自微乳(TAⅢ SMEDDS)的制备方法。以IPM为油相，Labrasol(∶) Cremophor EL(3∶1)为乳化剂，Transcutol HP为助乳化剂，制备TAⅢ自微乳。 通过溶解度以及不同辅料的成乳能力考察，确定了油相比例为10％、乳化剂比例为50％、助乳化剂比例为40％。对制备的三批样品进行粒径测定，测得粒径为24.09-38.22nm，载药量为1％，表明TAⅢ SMEDDS的处方合理、制备工艺稳定。 研究单次口服给予TAⅢ及TAⅢ SMEDDS在SD大鼠体内的药动学行为。研究结果表明，大鼠灌胃TAⅢ后，低、中、高剂量组的TAⅢ体内的药-时过程均符合一室模型。在大鼠体内分布速度较慢，体内消除速度较快，体内滞留时间较长。低、中、高剂量灌胃组大鼠血浆中TAⅢ，最大浓度Cmax和药时曲线下面积AUC均随着剂量的增加而增加。TAⅢ SMEDDS口服后，药物的药物动力学行为发生明显变化。与等剂量混悬剂相比，TAⅢ SMEDDS口服给药后，相对生物利用度F为185％。本文的研究结果为有效抗肿瘤药物TAⅢ的研制提供了实验基础。
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