摘要
目的 近几年耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的感染率呈逐年上升的趋势，且出现了多重耐药的特点，目前治疗MRSA的常用药物主要为糖肽类抗生素万古霉素，临床上出现了万古霉素敏感性下降甚至完全耐药的金黄色葡萄球菌。包括异质性万古霉素中介的金黄色葡萄球菌(heterogeneous vancomycin-intermediateStaphylococcus aureus，hVISA)和万古霉素中介的金黄色葡萄球菌(vancomycin-intermediate Staphylococcus aureus，VISA)。目前，关于VISA和hVlSA的低水平耐药机制尚没有定论，但是在hVlSA和VISA中发现了一些不同于万古霉素敏感的金黄色葡萄球菌(VSSA)的耐药表型和分子特征的改变。 本研究通过比较临床分离的VSSA，hVISA/VISA菌株的体外药敏情况，耐药表型特征，并对hVISA/VISA进行万古霉素体外诱导，检测hVISA/VISA诱导株与原始株表型特征及生物膜形成基因icaA，icaR，自溶素基因atlA，耐药相关基因RNAⅢ的基因转录水平，初步探讨临床hVISA/VISA菌株低水平耐药机制及其致病力变化。 方法 1、实验菌株选取:选取由临床各类型标本分离的757株非重复金葡菌，经由BHIA-3V筛选法初筛，PAP-AUC（菌群谱型分析法）确认的76株hVISA，4株VISA，20株VSSA。 2、体外药敏实验:应用微量肉汤稀释法，检测万古霉素及新型治疗hVISA/VISA药物，包括替考拉宁，利奈唑胺，达托霉素对hVISA/VISA的最小抑菌浓度(MIC)。 3、通过生物膜形成实验和自溶活性实验，研究临床分离VSSA，hVISA/VISA菌株的耐药表型特征变化。 4、万古霉素体外诱导hVISA/VISA:利用万古霉素浓度递增连续培养的方法对hVISA/VISA进行体外诱导。并通过多位点序列分型(MLST)检测hVISA/VISA诱导株与原始株的同源性。 5、分析hVISA/VISA诱导株对万古霉素敏感性改变情况，检测hVISA/VISA诱导株与原始株细胞壁厚度等形态特性及生物膜形成，自溶活性的变化。 6、利用实时荧光定量PCR(real-time PCR)检测hVISA/VISA诱导株与原始株每对菌株生物膜形成相关基因icaA，icaR，自溶素基因atlA，耐药相关基因RNAⅢ的转录水平，并通过2-△△Ct方法进行相对定量。分析icaA，icaR， atlA、RNAⅢ基因转录水平与生物膜形成及自溶活性的相关性。 结果 1、80株hVISA/VISA对利奈唑胺，达托霉素均敏感，未发现利奈唑胺，达托霉素耐药菌株。万古霉素MIC为1、2、4ug/ml的金葡菌分别有21株(26％)、55株(69％)、4株(5％)，替考拉宁MIC为1、2、4、8和16ug/ml的金葡菌分别有16株(20％)、30株(37.5％)、28株(35％)、3株(0.375％)、3株(0.375％)。 2、生物膜形成实验的结果显示，VSSA、hVISA和VISA的生物膜OD值中位数分别为2.709(1.587-3.760)、1.598(0.942-2.397)和1.140(0.824-1.477)。自溶实验表明，临床hVISA/VISA菌株的自溶活性较VSSA显著降低。 3、万古霉素体外诱导hVISA/VISA:选取10株hVISA/VISA，经过万古霉素选择性培养连续传代28-31天，分别有2、2、1、5株能分别在万古霉素浓度为6μg/ml、10μg/ml、14μg/ml，16μg/ml的BHI培养基上稳定生长。诱导株与原始株MLST分型一致。 4、hVISA/VISA诱导株形态主要改变为:细菌的菌落变小且有小结节状凸起、色素减少，透射电镜观察显示诱导株细胞壁显著增厚。对比诱导前后hVISA/VISA万古霉素MIC值:万古霉素对hVISA诱导株较诱导前的MIC增高1～1.5倍，但VISA诱导株较诱导前的MIC没有改变。hVISA/VISA诱导株的生物膜粘附能力和自溶活性均减弱。 5、Real-time PCR检测显示hVISA/VISA诱导株生物膜形成基因icaA，icaR;自溶素基因atlA，耐药相关基因RNAⅢ的表达量分别平均是原始株的0.61、2.72、0.74、0.52倍。 结论 1、临床常用治疗hVISA/VISA的糖肽类药物之间出现交叉耐药现象，在临床选择更换治疗hVISA/VISA药物时，应避免选择同类抗菌药物。 2、与VSSA相比，hVISA/VISA临床菌株的生物膜形成能力下降及自溶活性显著下降。hVISA/VISA低水平耐药可以导致致病力的改变。 3、体外万古霉素不易诱导hVISA/VISA完全耐药，hVISA在一定时间万古霉素的暴露下MIC值有所增加呈不稳定性。但诱导后形态特性改变可导致常规方法细菌鉴定结果错误，应引起重视。 4、在万古霉素作用下可以引起hVISA/VISA的icaA，icaR，atlA，RNAⅢ基因转录水平的改变而引起生物膜形成能力及自溶活性的变化。
NETL