摘要
目的 结肠癌是常见的恶性肿瘤之一，以40岁～50岁年龄组发病率最高，全球每年新发病例约800万人，占所有恶性肿瘤的10％～15％。结肠癌在我国的发病率有增高的趋势，死亡率仅次子肺癌和肝癌，占我国恶性肿瘤第三位。 Beclin1基因也称BECN1基因，是酵母ATG6的同系物，也是哺乳动物参与自噬的特异性基因。Beclin1不仅参与自噬体的形成，还可通过调节自噬活性对肿瘤发生、发展起着重要作用。关于自噬基因Beclin1与非小细胞肺癌，乳腺癌，宫颈癌等都有了相关的研究，但Beclin1与结肠癌在体内外关系的研究还很少。本研究旨在利用Beclin1基因在结肠癌细胞HCT15和HCT116细胞中过表达，对细胞的自噬、凋亡、侵袭、生长活性及相关基因表达进行检测，以此来研究Beclin1基因过表达对结肠癌细胞生物学特性的影响，初步探索自噬基因Beclin1的在结肠癌中的分子机制。 方法 设计特异引物利用RT-PCR方法从HCT15细胞总RNA反转录Beclin1 cDNA，并连接到pUCm-T载体中，进行酶切鉴定及测序。将测序正确的pUCm-Beclin1克隆DNA及pcDNA3.1/myc-his(+)质粒DNA扩增，分别进行EcoRⅠ、XbaⅠ双酶切，纯化Beclin1和pcDNA3.1/myc-his(+)片段，连接，转化，扩增，酶切鉴定及测序。将构建的Beclin1质粒分别转染HCT15、HCT116细胞并进行G418筛选建立稳定克隆细胞系，在DNA水平进行鉴定，分别在RNA水平和蛋白水平上对pcDNA3.1/myc-his-Beclin1质粒进行表达检测，筛选获得Beclin1高表达结肠癌阳性克隆细胞株，并进行相关实验检测，用Western Blot检测LC3BⅡ、LC3BⅠ蛋白表达，免疫细胞化学检测自噬蛋白LC3B表达，电镜下观察克隆细胞株亚细胞形态变化;用AnnexinⅤ-FITC细胞凋亡检测试剂盒进行细胞凋亡检测;用细胞增殖试剂盒(CCK)检测细胞生长;采用Transwell侵袭实验来研究Beclin1基因过表达对细胞迁移和迁徙的影响;利用Real-time PCR和Western Blot实验在RNA水平和蛋白水平检测相关基因的表达。 结果 1、Beclin1过表达HCT15和HCT116克隆细胞株， LC3B蛋白表达增强，并可见明显自噬小体。 2、Beclin1过表达HCT15和HCT116克隆细胞株细胞凋亡率增强(P＜0.05)。 3、Beclin1过表达HCT15、HCT116稳定细胞株生长速率低于正常对照HCT15、HCT116细胞（P＜0.05）。 4、Beclin1过表达HCT15和HCT116克隆细胞株侵袭和迁徙力均低于正常对照HCT15、HCT116细胞(P＜0.05)。 5、Real-time PCR结果显示，Beclin1过表达HCT15克隆细胞株mToR，Akt2，Bax，Bcl2，VEGF表达均上调;CyclinE1表达下调。Beclin1过表达HCT116克隆细胞株mToR，Akt2，CyclinE1表达上调，Bax，Bcl2，VEGF表达下调(P＜0.05)。 6、Western Blot结果显示，Beclin1过表达HCT15克隆细胞株PI3K，CDK4，C-myc，Bax，Bcl2，JNK表达上调;CyclinE，CDC-2表达下调。Beclin1过表达HCT116克隆细胞株CDC-2，CDK4表达上调;PI3K，CyclinE，C-myc，Bax，Bcl2，JNK表达下调(P＜0.05)。 结论 1、在结肠癌细胞HCT15和HCT116中Beclin1过表达后，细胞自噬活性和凋亡增强，细胞迁移和侵袭能力减弱，肿瘤细胞生长受到抑制。 2、HCT15和HCT116两个阳性克隆株相比，某些基因表达有所不同，我们推测HCT15和HCT116阳性克隆株过表达的Beclin1，可能通过不同的机制影响两种细胞的生长、自噬与凋亡，其原因可能与p53突变相关。
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