摘要
几丁质酶作为木霉菌防治植物病虫害的主要因子，在生物防治和环境保护等领域发挥着重要的作用。为了研究棘孢木霉（Trichoderma asperellum）几丁质酶及其酶学性质，明确生防机制，将棘孢木霉几丁质酶基因tachi1（不舍信号肽）克隆到分泌性表达载体pPIC9K上，构建重组表达质粒pPIC9K/tachi1，电击转化毕赤酵母GS115，筛选获得了高效分泌表达几丁质酶Tachi1的酵母工程菌GS-tachi1-K，对其进行甲醇诱导培养，通过单因素和正交试验对Tachi1的表达条件进行优化，纯化目的蛋白并进行酶学性质的研究。结果表明，GS-tachi1-K的最佳表达条件:pH为6.5，甲醇诱导浓度为0.5％，起始细胞浓度为OD600=2，甲醇诱导时间为180 h;几丁质酶Tachi1活力可达17.93 U/mL，蛋白表达量为6.19 g/L;表达的几丁质酶表观分子量约为44 kDa，酶反应最适的温度和pH分别为50℃和5.5，具有较宽的温度、pH适用范围;50℃以下保持较高的酶活力，在碱性条件下稳定性较差;米氏常数Km和最大反应速度Vmax分别为6.537 g/L和47.37×103μmol/L·min; Tachi1受Ag+、Hg2+、Cu2+、Fe2+和高浓度的SDS及β-巯基乙醇强烈抑制。几丁质酶基因tachi1生物信息学分析显示，该基因编码424个氨基酸;Tachi1属于糖基水解酶18家族内切几丁质酶，包含SIGGW底物结合位点和FDGIDVDWE活性中心位点，信号肽长度为22个氨基酸;含有1个潜在的N-糖基化位点;二级结构以α-螺旋、β-折叠和无规则卷曲为结构元件，三级结构为（α/β）8的圆桶形结构。重组几丁质酶可抑制多种病原真菌菌丝生长、孢子萌发和芽管伸长，其中对板栗疫病病菌、杨树腐烂病病菌和苹果腐烂病病菌的菌丝生长抑制作用较强。
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