摘要
目的: 自身免疫性甲状腺炎(Autoimmune thyroiditis，AIT)是最常见的器官特异性自身免疫性疾病之一，包括桥本甲状腺炎(Hashimoto's thyroiditis，HT)，萎缩性甲状腺炎和产后甲状腺炎。HT是一种自身免疫性T细胞介导的，体液免疫共同参与的自身免疫性甲状腺炎，并以甲状腺内炎性细胞浸润和血清中高滴度的甲状腺特异性自身抗体为特征。鼠甲状腺球蛋白(mouse thyroglobulin，mTg)诱导的实验性自身免疫性甲状腺炎(Experimental autoimmune thyroiditis，EAT)模型是最能代表人HT的实验动物模型，该模型的易感性主要与遗传因素H-2相关，而环境和免疫相关因素等非H-2因素也参与了该模型的调控。传统的观点认为辅助性T细胞(Thelper, Th)1型细胞是EAT模型的主要致病性CD4+T细胞，尤其是Th1型细胞分泌的细胞因子干扰素γ(Interferonγ，IFNγ)在疾病的发生和发展中发挥着极其重要的作用。Th2型细胞的作用与Th1型细胞正好相反，Th2型细胞分泌的细胞因子白介素-4(Interleukin-4，IL-4)和白介素-10（Interleukin-10，IL-10）能够抑制Th1型细胞的增殖及其细胞因子IFNγ的作用，因此Th1型细胞与Th2型细胞的平衡是维持机体正常免疫环境的重要机制之一。除了传统的这两个T细胞亚群外，最近研究还发现一种新型的CD4+T细胞。它们不同于传统的Th1型和Th2型细胞，拥有自己独立的发育体系及致病途径，这群T细胞亚群特异性的分泌白介素-17(Interleukin-17，IL-17)等因子，被命名为Th17型细胞。很多研究已经证实了Th17型细胞在多种自身免疫性疾病中的致病作用，而最新的研究也发现了Th17参与了AIT的发病过程。因此，了解该亚群的特点，功能及相关致病机制对AIT的最新治疗具有非常重要的意义。自身免疫的出现往往与免疫耐受的异常有关，调节性T细胞(regulatory T cell，Treg)是维持免疫耐受的重要因素，很多自身免疫病的发生都与Treg的数量及功能的异常有关，而过继转移Treg治疗往往能够使疾病得到缓解，Treg的异常已经在AIT中得到证实。B细胞在自身免疫病中往往扮演致病性的角色，新近研究发现还存在一种新的具有免疫调节功能的B细胞亚群——调节性B细胞(Regulatory B cell，Breg)，而B10细胞（主要集中在CD19+CD5+CD1 dhiB细胞亚群），一种只分泌IL-10的B细胞，是近年来研究的热点，B10细胞的保护作用已经在多种自身免疫病及其动物模型中得到证实，我们先前的研究也发现了高碘诱发NOD.H-2h4小鼠发生自发性自身免疫性甲状腺炎(Spontaneous autoimmune thyroiditis，SAT)时CD19+CD5+CD1dhiB细胞的比例是下降的，这说明B10确实在AIT中发挥着重要的作用。IL-10因子作为经典Th2型细胞因子家族成员，以及调节性B10细胞的关键因子能够抑制过度的炎症反应，减轻炎症引起的组织损伤，促进组织修复，在固有免疫和适应性免疫中发挥重要作用。在过继转移甲状腺炎模型中IL-10的基因治疗能缓解甲状腺炎症，提示IL-10在AIT模型中的保护作用。既往研究显示具有H-2b和H-2d遗传背景的鼠系如BALB/c和C57BL/6，是EAT耐受型的，本研究拟通过mTg免疫IL-10敲除型(IL-10-/-)和IL-10野生型(IL-10+/+) BALB/c和C57BL/6小鼠，评估小鼠甲状腺炎发病情况，了解IL-10在EAT发生发展中的作用，并通过检测本模型中的Th1，Th2，Th17，Treg及CD19+CD5+CD1dhiB细胞及其相关因子的变化来探讨IL-10在EAT发病中的作用，为进一步探讨AIT的治疗方法提供理论依据。 方法: 两种IL-10-/-鼠B6.129P2-IL-10tm1Cgn/J（002251，IL-10-/-C57BL/6）和C.129-IL-10tm1Cgn(004333，IL-10-/-BALB/c)均购买自美国Jackson公司。通过与IL-10+/+BALB/c和IL-10+/+ C57BL/6近亲繁育，鼠尾PCR鉴定得到足量的IL-10+/+ BALB/c、IL-10-/-BALB/c和IL-10+/+ C57BL/6、IL-10-/-C57BL/6各种品系小鼠。随机选取6-8周龄各种品系雌鼠，每种品系小鼠分为mTg+弗氏佐剂免疫组及仅予弗式佐剂对照组，并以mTg+弗氏佐剂免疫相同周龄的CBA/J EAT易感鼠作为阳性对照组。分别给予不同剂量的mTg+弗氏佐剂皮下注射，共免疫2次，每次间隔7天，初次免疫后28天麻醉处死。留取各组小鼠血清和甲状腺组织。酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked Immunoabsorbantassay，ELISA)测定各组小鼠血清甲状腺球蛋白抗体(Antithyroglobulin antibody，TgAb)水平;HE染色观察淋巴细胞浸润情况并进行甲状腺炎症程度评分，最终确定mTg免疫的最佳剂量。另外选择6-8周龄各种品系雌鼠，每种品系小鼠分为mTg+弗氏佐剂免疫组及弗式佐剂对照组。分别给予最佳剂量的mTg皮下注射，共免疫2次，每次间隔7天，初次免疫后28天麻醉处死。同样留取各组小鼠血清和甲状腺组织进行检测;制备各组小鼠脾脏单个核细胞悬液，免疫荧光染色流式细胞仪分析各T细胞亚群、B细胞及CD19+CD5+CD1dhiB细胞比例的变化;提取各组小鼠脾细胞总RNA，实时定量RT-PCR检测Th1型细胞特异性转录因子T-bet及分泌的细胞因子IFNγ mRNA表达水平;Th2型细胞特异性转录因子GATA3及分泌的细胞因子IL-4 mRNA表达水平;Treg细胞特异性转录因子Foxp3及其调节因子TGFβ mRNA表达水平; Th17型细胞的特异性转录因子RORγt及分泌的细胞因子IL-17 mRNA表达水平。结果以均数±标准差表示，组间比较采用t检验或方差分析进行统计分析，应用SPSS16.0软件处理和分析数据。 结果: 100μg和200μg的mTg分别免疫各组IL-10-/-小鼠，只有200μg的mTg免疫的IL-10-/-C57BL/6和IL-10-/-BALB/c小鼠血清TgAb水平明显升高（比较接近阳性对照鼠CBA/J TgAb水平），且甲状腺组织有不同程度的淋巴细胞浸润(P＜0.05)。200μg mTg免疫组两种IL-10-/-鼠均发生了EAT，IL-10-/-BALB/c鼠EAT发生率约为25％，IL-10-/-C57BL/6鼠EAT发生率约为33.3％。IL-10-/-C57BL/6和IL-10-/-BALB/c mTg组脾CD19+B细胞比例均较其对照组及IL-10+/+鼠mTg组明显升高(P＜0.05)，且TgAb的升高与CD19+B细胞比例呈现明显的正相关(P＜0.05);IL-10-/-C57BL/6和IL-10-/-BALB/c EAT组脾Th1型(CD4+IFNγ+ T)和Th17型(CD4+IL-17+ T)细胞百分比均显著高于其它各组(P＜0.01)，以Th17型细胞升高的更明显(P＜0.01)，Th1型和Th17型细胞的转录因子T-bet和RORγt及它们分泌的细胞因子IFNγ和IL-17 mRNA表达量也呈现同样的结果(P＜0.01); Th2型(CD4+IL-4+ T)细胞百分比在各组之间没有明显差异(P＞0.05)，Th2型细胞的转录因子GATA3及其分泌的细胞因子IL-4 mRNA表达量也呈现同样的结果(P＞0.05);IL-10-/-C57BL/6和IL-10-/-BALB/c EAT组脾Treg(CD4+CD25+Foxp3+T)细胞百分比均较其它各组明显降低(P＜0.01)，Treg细胞的转录因子Foxp3mRNA表达量也呈现同样的结果(P＜0.01)，但其调节因子TGFβ mRNA表达量在各组之间无明显差异(P＞0.05)，CD19+CD5+CD1dhiB细胞百分比均高于其它各组(P＜0.05)。 结论: 1.200μg mTg免疫IL-10-/-BALB/c鼠和IL-10-/-C57BL/6鼠可诱导发生EAT，成模率分别为25％和33.3％。IL-10也能够影响EAT的易感性，但其作用远不如遗传因素H-2基因的作用明显。 2.升高的B细胞比例可能是血清高TgAb的产生机制之一，CD19+CD5+CD1dhiB细胞、Th1，Th17，Treg细胞均在EAT模型的发病过程中发挥作用。IL-10可能通过改变上述细胞所占的比例及其相关因子影响了EAT的发生。
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