摘要
目的： 研究CKs1、CKs2对肝癌细胞HepG2增殖、凋亡及细胞周期调控的影响，探究肝细胞癌致病机理，为肝细胞癌临床治疗提供新的线索。 方法： 1、设计并合成分别针对Cks1、Cks2基因的SiRNA序列，以脂质体介导，转染肝癌细胞株HepG2，干扰目的基因的表达； 2、构建分别针对Cks1、Cks2基因的pcDNA3.1/Hygro-IRES2-EGFP质粒载体，使用脂质体介导，转染肝癌细胞株HepG2，增强目的基因的表达，建立过表达稳定转染细胞系； 3、转染后收集细胞，应用real-time PCR分别检测Cks1、Cks2mRNA表达水平。应用western blot分别检测Cks1、Cks2蛋白质表达情况。 4、运用CCK-8和细胞计数方法检测干扰和增强后细胞的增殖情况； 5、应用Annexin-V/PI双染细胞，以顺铂诱导细胞凋亡，流式细胞术分析干扰和增强后细胞凋亡情况。 6、使用PI染色，流式细胞术分析干扰和增强后细胞周期变化。 7、选取若干个与细胞生存、增殖密切相关的蛋白质——Akt、GSK-3β、Bcl-2，在目的基因干扰后进行western blot检测，观察蛋白表达的变化。 结果： 1、RNA干扰后24-96小时，Cks1、Cks2 mRNA和蛋白表达水平明显下降，蛋白水平以转染后48小时干扰效果最佳。 2、筛选出Cks1、Cks2过表达稳定细胞系。 3、CCK-8和细胞计数检测显示：干扰细胞内源性Cks蛋白之后，HepG2细胞的增殖速度减慢；而过表达Cks蛋白能够促进细胞增殖。 4、细胞凋亡流式检测结果显示：HepG2细胞的凋亡率随着 Cks蛋白表达的下调而增高；Cks蛋白表达水平的升高，使细胞凋亡率减少。 5、周期实验分析表明：过表达Cks1，能够促进HepG2细胞由G0/G1期进入S期。 6、Akt、GSK-3β蛋白的磷酸化部分pAkt、pGSK-3β在Cks1、Cks2 RNA干扰后，表达出现下降的趋势，差异具有统计学意义。Bcl-2蛋白表达水平并未出现明显的改变。 结论： 1、Cks1、Cks2可以促进HepG2细胞的增殖，抑制其凋亡，在肝细胞癌的发生、发展过程中，可能扮演癌基因的角色。 2、Akt、GSK-3β相关的PI3K/Akt信号通路或许是Cks1、Cks2影响细胞增殖、凋亡的途径之一。
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