摘要
本研究结合电化学分析可不受样品的浊度、颜色的影响,所需设备仪器相对简单的特点以及酶促反应的高效性、免疫分析无需对样品进行纯化、富集等预处理的特点,以玻碳电极为基体电极,采用共价键合、静电吸附和自组装单分子层等生物分子固定技术,并借助纳米金的吸附能力强、比表面积大、良好的生物相容性和隧道效应等特性以及壳聚糖良好的成膜性、机械性能、生物相容性等特性构建了性能良好的苏氨酸磷酸裂合酶(phosphothreonine lyase, SpvC)电化学纳米金免疫传感器应用于食品安全检测分析中。 借助于生物分子相互作用仪(Octet? biolayer interferometry)从五株抗SpvC单克隆抗体(以沙门氏菌为抗原制备)中筛选出与SpvC纯化蛋白亲和力最强的单克隆抗体株,其解离平衡常数KD分别为:3.85E-10M、1.65E-09M、5.88E-10M、2.01E-09M、1.13E-09M,KD最小3.85E-10M即为亲和力最强的单克隆抗体株,其结合常数Kon和解离速度常数Kdis分别为3.73.E+03L/mol s-1,9.62E-07 s-1。 采用以纳米金-硫堇-壳聚糖吸附辣根过氧化物酶为生物传感的放大系统,方法如下:将玻碳电极预处理后,取5μL0.5%壳聚糖溶液滴于电极表面,自然晾干制备的纳米金溶胶中24h,然后将该电极置于互作仪所筛选的抗SpvC单克隆抗体中4℃自组装24h,即得单层纳米金修饰的传感器。再取5μL制备的硫堇/壳聚糖共聚物溶液滴加于上述电极表面的中心,自然干燥后将该电极置于纳米金/辣根过氧化物酶溶液中4℃自组装24h,再将该电极置于抗SpvC单克隆抗体中4℃自组装24h,最后将该修饰电极置于BSA溶液(1g/100mL)中37℃温育1h,以封闭非特异性位点,以含0.05%(v/v) Tween-20的PBST溶液清洗未结合的牛血清白蛋白,自然晾干即得双层纳米金修饰的SpvC电化学免疫传感器,置于4℃PBS缓冲环境中保存待用。 通过纳米金溶胶吸附抗SpvC Balb/c小鼠单克隆抗体,利用紫外光谱扫描、透射电镜表征纳米金,原子力显微镜、循环伏安及交流阻抗法表征其吸附和组装的各阶段,研制出电化学型纳米金双膜免疫传感电极。利用电流时间曲线法分别测定 PBS稀释的沙门氏菌和志贺氏菌悬液,结果表明响应电流与两种菌在10-1.0×104 cfu/mL范围内线性相关,最低检测限为5cfu/mL,线性方程分别为:△I=0.2103C+0.0256(R2=0.9943),△I=0.2044C+0.0263(R2=0.9904),由方程斜率表明抗体与沙门氏菌有更好地亲和力,这可能是SpvC来源于沙门氏菌的原因。再利用时间电流曲线法测定 PBS稀释的两种菌混合液,线性方程为:△I=0.2078C+0.026(R2=0.9913),表明该传感器可以检测这两种混合菌液中菌总浓度。并对其寿命、稳定性、重现性及选择性进行了初步研究,结果证实该传感器具有一定的使用价值,为进一步用于食品安全检测奠定了基础。
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