摘要
第一部分: SPOP在人胃癌组织中的表达及其与临床病理特征的关系 目的:探讨SPOP在人胃癌细胞系、人胃癌组织中的表达及临床意义。 方法:免疫组织化学方法检测101例胃癌组织及相应癌旁组织的SPOP的表达,统计分析其与临床病理特征的关系;Western blot方法检测4例胃癌组织及癌旁组织的SPOP的表达;Western blot方法检测4株胃癌及1株永生化正常胃黏膜上皮细胞株细胞中的SPOP的表达。 结果:1、101例胃癌组织中,88例癌组织中的SPOP的表达低于相应的癌旁组织,两者差异具有统计学意义(P<0.05)。SPOP在癌组织中的表达与淋巴结转移成正相关(r=0.225,P<0.05),与肿瘤分化程度(r=-0.232,P<0.05)及TNM分期(r=-0.375,P<0.01)成负相关,但与患者的年龄、性别均不相关;2、Western blot检测4例癌组织中SPOP表达均低于相应的癌旁组织;3、在人永生化胃粘膜上皮细胞系GES-1及四株胃癌细胞株AGS,SGC-7901,MKN-28,MKN-45中均有表达。 结论:1、SPOP在胃癌组织中表达下调,与癌旁组织中的表达比较存在统计学差异(P<0.05);2、SPOP表达与患者的淋巴结转移、肿瘤分化程度及TNM分期相关,但与患者性别、年龄均不相关。 第二部分:SPOP基因表达质粒和SPOP-shRNA质粒构建及胃癌细胞模型的筛选与鉴定 目的:为了进一步研究SPOP在胃癌中的作用机制,我们构建SPOP基因表达质粒SPOP-V5/His和干扰质粒SPOP-shRNA质粒,并构建SPOP高/低表达胃癌细胞模型。 方法:1、通过基因克隆技术获得人SPOP基因cDNA序列,将其克隆,酶切,连接载体pUB6/V5-HisB,构建SPOP基因表达质粒SPOP-V5/His,并构建表达SPOP的胃癌稳转细胞系,利用免疫印迹法鉴定表达产物;2、针对人SPOP基因的pcDNATM6.2-GW/EmGFP载体构建SPOP-shRNA质粒,免疫印迹法鉴定表达产物,用脂质体转染技术转染MKN45细胞并流式细胞仪分选,构建低表达SPOP的胃癌细胞模型,利用免疫印迹法鉴定表达产物。 结果:1、成功构建SPOP-V5/His表达质粒;2、以AGS为基础成功构建了稳转表达SPOP的胃癌细胞系模型;3、成功构建SPOP干扰质粒SPOP-shRNA,经Western blot鉴定显示 SPOP-shRNA-1430的干扰效果最好;4、将SPOP-shRNA-1430转染到MKN-45胃癌细胞中,流式细胞仪分选,成功构建了低表达SPOP的胃癌细胞模型。 结论:成功构建SPOP-V5/His表达质粒和SPOP-shRNA质粒,并构建SPOP基因过表达和低表达的胃癌细胞模型。 第三部分: SPOP对胃癌细胞生物学行为的影响 目的:研究SPOP对胃癌细胞生物学行为的影响。 方法:利用本研究第二部分建立的SPOP表达质粒SPOP-V5/His构建过表达SPOP的胃癌细胞模型;利用SPOP干扰质粒SPOP-shRNA,构建低表达SPOP的胃癌细胞模型,采用MTT法检测、划痕实验、平板克隆形成实验,体外观察SPOP表达改变后,对胃癌细胞增殖、迁移、克隆形成等生物学行为的影响。 结果:MTT法检测证实过表达SPOP抑制胃癌细胞AGS增殖能力,抑制SPOP表达后促进胃癌细胞MKN-45的增殖;划痕实验证实过表达SPOP能够降低AGS细胞的迁移能力,抑制SPOP表达后能够增强MKN-45细胞的迁移能力;克隆形成实验显示过表达SPOP抑制AGS细胞克隆形成,抑制SPOP表达后促进MKN-45细胞克隆形成。 结论:SPOP具有抑制胃癌细胞增殖、迁移及克隆形成的作用,有可能成为胃癌治疗的新型候选靶点或诊断指标。 第四部分: SPOP通过Hh/Gli信号通路影响胃癌细胞生物学行为的机制研究 目的:研究SPOP对Hh/Gli信号通路的调控作用。 方法:免疫共沉淀、免疫细胞化学实验检测SPOP与Gli2存在相互作用;建立SPOP表达质粒Myc-SPOP转染HEK-293T细胞株,检测其对Gli2的影响及对下游靶基因的影响; Dual Luciferase reporter试验检测SPOP对Hh/Gli信号通路的影响。 结果:免疫共沉淀实验检测证实SPOP与Gli2存在相互作用;免疫细胞化学实验中激光共聚焦观察到Gli2表达与胞浆中SPOP表达呈负相关关系;增加SPOP的表达可降低Gli2的蛋白水平,但不影响其mRNA水平;增加SPOP的表达可促进促凋亡因子PARP及Caspase-3的增加;Dual Luciferase reporter试验证实增加SPOP的表达,Hh/Gli信号通路的活性逐渐降低,因此SPOP降低Hh/Gli信号通路的活性。 结论:SPOP通过降低Gli2的蛋白水平,抑制Hh/Gli信号通路的活性,促进细胞凋亡,由此可能成为影响胃癌发生发展的主要机制。
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